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Rasmus Linser
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Forschungsbericht (importiert) 2016 - Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie

Protonen als sensitive Reporter von molekularen Zusammenhängen

Protons as sensitive reporters for molecular details

Autoren

Linser, Rasmus

Abteilungen

Emmy-Noether-Forschungsgruppe Festkörper-NMR-Spektroskopie

DOI

10.17617/1.J

Viele Proteine, zu denen Informationen zum Verständnis ihrer biologischen Funktion gewonnen werden sollen, sind herkömmlichen Methoden nicht zugänglich. Die Forschungsgruppe befasst sich daher mit der Entwicklung und Anwendung von kernmagnetischer Resonanzspektroskopie zur Charakterisierung von Struktur und Dynamik von Proteinen der Festphase. Durch Methodenentwicklung in der Festkörper-NMR können bereits bestehende Möglichkeiten zum Verständnis von Proteinen verbessert werden mit dem Erfolg, weitere Proteine unter atomarer Auflösung zu charakterisieren.
Many proteins in the focus of structural-biology studies cannot be elucidated by conventional methodology. The research group Solid-State NMR hence is concerned with the development and application of NMR (nuclear magnetic resonance) methods dedicated for the characterization of structure and dynamics of solid proteins. Developing improved methodology for solid-state NMR helps to make more targets amenable for their characterization with atomic resolution.

Was ist interessant an der Struktur und Dynamik von Proteinen?

Das Funktionieren unserer molekularen Maschinen auf zellulärer Ebene wird in den meisten Fällen durch ihre spezifische dreidimensionale Struktur mitbestimmt. So werden in Eiweißen spezifisch geformte und elektrostatisch geladene Flächen, Taschen und Anker ausgebildet, die die Interaktion von Proteinen individuell gestalten. Damit können in der Zelle auf unterschiedlichste Art und Weise Molekülerkennung und Kommunikation, Zellgestalt und Transport erreicht werden.

Dazu kommt die Beweglichkeit einzelner Strukturelemente, wodurch Proteine und andere Komponenten der Zelle zu molekularen Maschinen werden. Die Bewegungen, die wiederum durch Interaktionen mit anderen Molekülen beeinflusst werden können, ermöglichen den Ablauf von chemischen Reaktionen, wie zum Beispiel bei der enzymatischen Katalyse, Gestaltsveränderungen von Zellstrukturen, beispielsweise für Bewegungsvorgänge, gerichteten Transport und viele andere Funktionen, die für das Leben der Zelle unabdingbar sind. Da die Struktur und Dynamik von Proteinen für deren Funktion von grundlegender Bedeutung sind, stellt ihre Charakterisierung einen Schlüssel zum Verständnis derjenigen Prozesse dar, die das Leben der Zelle ermöglichen.

Solche Funktionalitäten zu verstehen verspricht außerdem eine Reihe von Möglichkeiten, gezielt einzugreifen, wenn, besonders im Falle von Krankheit, etwas auf der zellulären Ebene schiefgeht. Es können beispielsweise geeignete Inhibitoren synthetisiert werden, die molekulare Interaktionen verhindern und so unerwünschte Prozesse in der Zelle abstellen oder Zellen, die nicht körpereigen oder funktional sind, an ihrer Ausbreitung hindern. Neben kleinen Molekülen - die klassischen Medikamente - können auch größere Moleküle wie Antikörper zur Wechselwirkung mit anderen Molekülen maßgeschneidert werden. Außerdem stellt das Verständnis der Proteinstruktur, -dynamik und -funktion die Grundlage dar für die Aufklärung fundamentaler Zusammenhänge in der Zelle, mit deren Kenntnis man gesundes und krankes Verhalten von Geweben, Organen und ganzen Organismen erklären kann.

Proteinstruktur mit atomarer Auflösung kann durch die Kristallisation von Proteinen, durch Lösungs-NMR-Spektroskopie, Elektronenmikroskopie oder anderen Methoden erhalten werden. Jede dieser Techniken hat Stärken für bestimmte Anwendungsfelder, jedoch Schwächen für andere. Besonders solche Proteine, die nicht wasserlöslich sind und nicht kristallisieren, stellen beachtliche Hürden für die Strukturbiologie dar. Das sind zum Beispiel solche Proteine, die unter physiologischen Bedingungen in Lipidmembranen verankert sind, oder Proteinaggregate, wie sie natürlicherweise in manchen Organismen vorkommen oder bei vielen neurodegenerativen Krankheiten wie Alzheimer oder Parkinson entstehen. Für viele dieser Proteine kann Festkörper-NMR-Spektroskopie eine Möglichkeit sein, ihre  molekularen Details aufzuklären [1].

Wie funktioniert Festkörper-NMR?

Kernmagnetische Resonanz (Englisch: nuclear magnetic resonance, NMR) basiert auf der Wechselwirkung des magnetischen Momentes von Atomkernen mit einem äußeren magnetischen Feld. Durch Wechselwirkung mit Radiofrequenzpulsen können die Kernzustände beeinflusst und die Resonanzfrequenz eines jeden einzelnen Kerns des Moleküls ausgelesen werden. Außerdem lassen sich Gruppen räumlich benachbarter Kerne sowie ihre Distanzen untereinander zusammen auslesen, was eine indirekte Bestimmung der Proteinstruktur ermöglicht. Neben diesen Strukturinformationen fungieren die erhaltenen Signale als sensitive Reporter für die Bewegung der einzelnen Proteinbestandteile. Sowohl die Amplitude, die das Ausmaß der Bewegung wiedergibt, als auch die Zeitskala, auf der sich die Bewegung abspielt, kann mit Hilfe der NMR Signale für jedes Atom spezifisch gemessen werden.

Um im Festkörper NMR-Signale erhalten zu können, die für die Auswertung günstige Eigenschaften aufweisen, werden die Proteinproben in der Solid-State NMR in einem sogenannten Rotor - einem Zylinder von einigen Millimetern Länge - um die eigene Achse rotierend vermessen. Da der Rotor und somit die Drehachse aus physikalischen Gründen in einem bestimmten Winkel zum Magnetfeld ausgerichtet sind, nämlich dem sogenannten Magic Angle von 54 Grad, spricht man von Magic Angle Spinning (Abb. 1).

<strong>Abb. 1:</strong> (<strong>A</strong>) Mittels kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (NMR) können feste Proteine in schnell um die eigene Läng Bild vergrößern
Abb. 1: (A) Mittels kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (NMR) können feste Proteine in schnell um die eigene Längsachse rotierenden Rotoren innerhalb starker Magnetfelder vermessen werden. Die Rotoren drehen während der Messungen wochenlang stabil mit bis zu 100.000 Umdrehungen pro Sekunde. (B) Größendarstellung der verwendeten Rotoren. [weniger]

Diejenigen Atomkerne, die am stärksten mit dem äußeren magnetischen Feld wechselwirken, nämlich die Kerne von Wasserstoffatomen, also Protonen, wurden in der Festkörper-NMR lange Zeit praktisch ausgespart. Aus diesem und anderen Gründen hat die Festkörper-NMR den Charakter einer eher unempfindlichen - beispielsweise muss man große Mengen an Protein für eine Messung einsetzen - und messzeitintensiven Methode.

Wie helfen uns Protonen?

Protonen sind erst in den vergangen Jahren für die Festkörper-NMR-Spektroskopie zugänglich geworden (Abb. 2A). Sie benötigen für verwertbare NMR-Signale sehr schnelles Magic-Angle-Spinning und zudem noch eine Verdünnung mit dem weniger NMR-aktiven Wasserstoffisotop Deuterium.

<strong>Abb. 2: (A)</strong> Mehrdimensionale Spektren werden genutzt, um Korrelationen von Resonanzfrequenzen für diejenigen Atomkerne zu erhalten, d Bild vergrößern
Abb. 2: (A) Mehrdimensionale Spektren werden genutzt, um Korrelationen von Resonanzfrequenzen für diejenigen Atomkerne zu erhalten, die in unmittelbarer räumlicher Nähe zueinander sind. (B) Atomar aufgelöste Molekülstruktur sowie Molekulardynamik, sowohl Zeitskalen als auch Amplituden betreffend, lassen sich indirekt über die Auswertung der NMR-Spektren charakterisieren. [weniger]

Diese Techniken konnten erst in den vergangenen Jahren entwickelt werden. Zum jetzigen Zeitpunkt sind Rotorfrequenzen von knapp über 100.000 Umdrehungen pro Sekunde möglich. Der Einsatz von Protonen zum Erhalt von NMR Signalen bietet damit ungeahnte Möglichkeiten. Zum einen können die notwendigen Probenmengen bei gleicher Sensitivität um eine Größenordnung niedriger gehalten werden, was den Einsatz der Technik für Proteine ermöglicht, die zuvor nicht in ausreichender Menge zur Verfügung gestellt werden konnten. Zum anderen ist nun Methodik verfügbar, die für eine höhere Verlässlichkeit der Ergebnisse sorgt.[2]: Dies ist von Bedeutung, wenn Proben nur mit geringer Homogenität herzustellen sind. Die Proben vieler Proteinaggregate, die zum Verständnis von neurodegenerativen Krankheiten untersucht werden, sind beispielsweise von Natur aus durch eine Verteilung von leicht unterschiedlichen Konformationen geprägt. Durch den dank Protonendetektion gewonnenen Sensitivitätsvorteil und durch die Verfügbarkeit der Protonenresonanzfrequenzen zusätzlich zu den herkömmlich verwendeten Kohlenstoff- und Stickstoffsignalen sind multidimensionale Experimente möglich, die die NMR Informationen mit hoher Verlässlichkeit exakt denjenigen Atomen der Moleküle zuordnen lassen, von denen sie stammen (Abb. 3; [3]).

<strong>Abb. 3:</strong> Wenn nur Kleinstmengen an Protein für NMR Messungen hergestellt werden können, sind für die Signaldetektion Protonen die Atom Bild vergrößern
Abb. 3: Wenn nur Kleinstmengen an Protein für NMR Messungen hergestellt werden können, sind für die Signaldetektion Protonen die Atomkerne der Wahl. Mit Hilfe komplexer Korrelationsexperimente, wie durch Korrelation von Kernresonanzfrequenzen der pink oder der violett verbundenen Atome (A), lässt sich selbst dann noch eine Charakterisierung durchführen (B: Auszug aus einer Signalzuordnung), wenn die Probenhomogenität eingeschränkt ist - wie hier im Falle von Proteinaggregaten gezeigt, die im Zuge der Alzheimer’schen Krankheit vorkommen. (C) Elektronenmikroskopie-Aufnahme solcher Aggregate am Beispiel des mit der Alzheimerkrankheit in Verbindung stehenden Proteins Tau. [weniger]

Auch in Bezug auf Proteinstrukturrechnung ermöglicht die Zugänglichkeit von Protonen gänzlich neue Herangehensweisen. Eine Vielzahl von Proteinen lässt sich deswegen momentan nicht strukturell aufklären, weil die derzeitigen Größenlimits der Technik überschritten werden. Durch neue Methoden in der Strukturanalyse lassen sich zukünftig größere Proteine charakterisieren, was den Einsatzbereich signifikant erweitern kann und die Methodenentwicklung in diese Richtung entsprechend unabdingbar macht. Beispiele für solche Methodik sind neue Arten des Magnetisierungsübertrags zwischen Atomkernen [4], präparative Ansätze zur Herstellung der Zielmoleküle mit maßgeschneiderten Isotopenmarkierungsmustern [5] oder der Einsatz von paramagnetischen Veränderungen der Proteine [6].

Ein anderer Fokus neben der Ermittlung der Proteinstruktur ist das bessere Verständnis der Dynamik von Proteinen und ihren Liganden. Eine umfangreiche und verbesserte Analyse von Proteindynamik lässt sich durch das Hinzunehmen von Parametern erreichen, die erst mit der Detektierbarkeit von Protonen zugänglich werden (s. Abb. 2B). Neben Studien, die die Funktion von konkreten Proteinen in bestimmten physiologischen Zusammenhängen ergründen [7], repräsentiert die Erforschung der Dynamik von Biomolekülen auch ein grundsätzliches wissenschaftliches Interesse, denn: Die Dynamik und Energetik unserer molekularen Maschinen gehören zu den physikalischen Grundlagen des Lebens und sind bisher nur zum Teil verstanden. Entsprechend stehen diese Fragestellungen in der Grundlagenforschung weit vorn.

Ausblick

In den Naturwissenschaften geben sich Entwicklung und Anwendung von Methodik oftmals die Hand. Bei der Festkörper-NMR ist die Methodenentwicklung momentan ein gewichtiger Faktor, der der Technik fortwährend neue Durchbrüche für ihre Anwendbarkeit, Empfindlichkeit und für den Umfang der mit ihr erhaltenen Erkenntnisse beschert. Es ist nicht verfehlt anzunehmen, dass man sich auf eine Vielzahl von physikochemischen und biologischen Studien freuen darf, die von den methodischen Erfolgen der Technik in der Zukunft profitieren werden.

Literaturhinweise

1.
Loquet, A.; Sgourakis, N.G.; Gupta, R.; Giller, K.; Riedel, D.; Goosmann, C.; Griesinger, C.; Kolbe, M.; Baker, D.; Becker, S.; Lange, A.
Atomic model of the type III secretion system needle
DOI
2.
Linser, R.; Bardiaux, B.; Hyberts, S.G.; Kwan, A. H.; Morris, V.K.; Sunde, M.; Wagner, G.
Solid-State NMR structure determination from diagonal-compensated, sparsely nonuniform-sampled 4D proton–proton restraints
DOI
3.
Xiang, S.; Biernat, J.; Mandelkow, E.; Becker, S.; Linser, R.
Backbone assignment for minimal protein amounts of low structural homogeneity in the absence of deuteration
DOI
4.
Vasa, S.K.; Rovo, P.; Giller, K.; Becker, S.; Linser, R.
Access to aliphatic protons as reporters in non-deuterated proteins by solid-state NMR
DOI
5.
Linser, R.; Gelev, V.; Hagn, F.; Hyberts, S.G.; Arthanari, H.; Wagner, G.
Selective methyl labeling of eukaryotic membrane proteins using cell-free expression
DOI
6.
Rovó, P.; Grohe, K.; Giller, K.; Becker, S.; Linser, R.
Proton transverse relaxation as a sensitive probe for structure determination in solid proteins
DOI
7.
Linser, R.; Salvi, N.; Briones, R.; Rovó, P.; de Groot, B. L.; Wagner, G.
The membrane anchor of the transcriptional activator SREBP is characterized by intrinsic conformational flexibility
DOI
 
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