Korrespondierender Autor

Christian Griesinger
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Neurobiologie • Strukturbiologie • Zellbiologie

Forschungsbericht (importiert) 2017 - Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie

Hin zu disease modifying therapies von neurodegenerativen Erkrankungen

Towards disease modifying therapies of neurodegenerative diseases

Autoren

Ryazanov, Sergey;  Leonov, Andrei; Griesinger, Christian

Abteilungen

NMR-basierte Strukturbiologie

DOI

10.17617/1.4W

Neurodegenerative Erkrankungen gehen mit der Aggregation von meist intrinsisch ungefalteten Proteinen einher. Aufgrund der Kenntnis der Strukturbiologie dieser Proteine war es möglich, Oligomere als attraktives Target für disease modifying therapies zu identifizieren und mit anle138b eine Substanz zu finden, die die erforderlichen Eigenschaften zur Beeinflussung der Aggregation hat und oral bioverfügbar ist.
Neurodegenerative diseases‘ hallmark is the aggregation of mostly intrinsically disordered proteins. Getting fundamental insights into the structural biology of these proteins, it was possible to identify oligomers as an attractive target for disease modifying therapies. The compound anle138b is bearing the required properties regarding modification of aggregation pathways, and is also orally bioavailable.

Alzheimer, Parkinson und Creutzfeld-Jakob sind die Folge von Neurodegeneration

Ein von Eliezer Masliah, mittlerweile Chef des National Institute on Aging, USA, veröffentlichter Übersichtsartikel beginnt mit dem Satz: The lack of disease-modifying treatments (DMT) for neurodegenerative diseases explains the need for developing new therapies that target the molecular origins of the pathology [1]. Disease modifying ist eine Therapie, bei der nicht die Symptome, sondern die Neurodegeneration selbst verlangsamt oder gar behoben wird, also der Verlust der Funktionalität der Neurone und ihr Absterben bestenfalls gestoppt oder wenigstens verzögert wird. Neurodegenerative Störungen schließen die am weitesten verbreitete Alzheimer-Erkrankung, die Amyotrophe Lateralsklerose, die Parkinson und Creutzfeld Jakob Krankheit ein. Im Zusammenhang mit degenerativen Erkrankungen wird auch Typ II Diabetes diskutiert.

Im Fokus aller dieser Erkrankungen stehen aggregierende Proteine, deren physiologische Funktion meist nicht bekannt ist und die weitgehend unstrukturiert in der Zelle vorliegen. Sie sind entweder vollständig wie beispielsweise α-Synuclein, tau oder IAPP unstrukturiert (IDP: intrinsically disordered proteins) oder teilweise strukturiert wie das Prion-Protein.

Die Forscher der Abteilung ermittelten durch NMR Spektroskopie die molekulare Struktur des α-Synucleins. Erkennbar wurden teilstrukturierte Monomere [2] über nur mäßig charakterisierte Oligomere [3] bis hin zu fibrillären Aggregaten (Abb. 1). Eine daraufhin in Kollaboration mit dem Forschungszentrum für Nanoskopie und molekulare Physiologie des Gehirns (CNMPB) der Universität Göttingen durchgeführte und umfangreiche Studie [4] legte für α-Synuclein die Vermutung nahe, dass am Ende die Oligomere des Proteins die akute Toxizität vermitteln und daher eine Inhibierung der Bildung dieser Oligomere notwendig und hinreichend für eine DMT wäre.

<strong>Abb. 1:</strong> Die verschiedenen Aggregatstufen von α-Synuclein: Monomer, toxische Oligomere, Fibrillen oder verbindungsstabiliserte Oligome Bild vergrößern
Abb. 1: Die verschiedenen Aggregatstufen von α-Synuclein: Monomer, toxische Oligomere, Fibrillen oder verbindungsstabiliserte Oligomere.

Die Suche nach Aggregationshemmern

Aus diesem Grund startete die Abteilung 2005 ein Programm zur Entwicklung von Aggregationsinhibitoren, die nicht nur die Fibrillenbildung, sondern auch das Entstehen von oligomeren Spezies blockieren sollten. Parallel dazu sollte möglichst früh die Bioverfügbarkeit der gefundenen Verbindungen getestet und wenn möglich optimiert werden. Diese Arbeiten wurden in Zusammenarbeit mit Armin Giese von der Ludwig-Maximilians-Universität München durchgeführt [5]. Er durchmusterte eine Bibliothek von rund 20.000 Verbindungen mit dem am hiesigen Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie entwickelten SIFT Verfahren, das bereits bei nanomolaren Konzentrationen des Proteins einsetzbar ist und es gestattet, Monomere von Oligomeren zu unterscheiden [6]. Als vielversprechende chemische Grundstruktur wurden Diphenylpyrazole (DPP) identifiziert, die die Aggregation von Prion-Protein und α-Synuclein bereits auf der Stufe der toxischen Oligomeren inhibierten.

Diphenylpyrazole sind in zwei bis drei Stufen aus kommerziell erhältlichen Verbindungen synthetisierbar. Bisher effizientester Vertreter aus der DPP Serie ist anle138b, das sich in Bezug auf Bioverfügbarkeit und Aggregationsinhibition als optimal erwies. Die Verbindung erreicht oral verabreicht im Mäusehirn Konzentrationen von etwa 100 µM und hat eine biologische Halbwertszeit von etwa 4 Stunden. Die Substanz wurde in verschiedenen Tiermodellen getestet, von denen hier nur zwei referiert werden sollen [3]. Das erste ist ein Modell für die Creutzfeld Jakob Erkrankung (CJD). Diese Krankheit ist vor etwa 20 Jahren verstärkt als juvenile Form im Zuge der BSE Infektion von Kühen aufgetreten. Darüber hinaus kommt die sporadische Form mit etwa 120 Fällen pro Jahr in Deutschland vor. Sie führt beim Menschen innerhalb weniger Monate zum Verlust zuerst sämtlicher kognitiver und schließlich vegetativer Funktionen.

Das CJD Mausmodell, das durch Inokulation von Prion-Protein (PrPsc) ins Hirn generiert werden kann, spiegelt die menschliche Verlaufsform der Krankheit sehr gut wider. Nach Inokulation sterben die Mäuse innerhalb von etwa 160 Tagen. Applikation von anle138b direkt nach der Inokulation dagegen induziert im Durchschnitt eine Lebenszeitverlängerung um etwa 200 Tage. Beginnt die Applikation von anle138b erst nach 80 oder 120 Tagen, so ist die Lebenszeitverlängerung weniger ausgeprägt. Die Verringerung der Aggregatmenge im Hirn zusammen mit der in vitro beobachteten Inhibition der Aggregation legt nahe, dass hier in der Tat eine Neuroprotektion durch eine Reduktion der Aggregation erreicht wird. Dazu passend wurde festgestellt, dass nicht nur die in histologischen Schnitten beobachteten Aggregate in ihrer Menge reduziert sind, sondern auch die Größenverteilung der oligomeren Spezies unterschiedlich ist, was durch Ultrazentrifugation und nachfolgende Identifizierung durch Antikörperreaktion bestätigt werden konnte: Bei den unbehandelten Mäusen treten größere Oligomere auf. Somit liegt es nahe, dass die Beeinflussung der Größenverteilung der Oligomere hin zu kleineren Oligomeren nach Applikation von anle138b ursächlich mit der verlängerten Überlebensdauer der Mäuse zusammenhängen könnte (Abb. 2).

<strong>Abb. 2:</strong> Einfluss von anle138b Verabreichung auf die Lebenszeit und Prionprotein-Ablagerung von Mäusen, die mit dem RML Scrapie Prion Bild vergrößern
Abb. 2: Einfluss von anle138b Verabreichung auf die Lebenszeit und Prionprotein-Ablagerung von Mäusen, die mit dem RML Scrapie Prion Protein infiziert wurden. (a) Die Applikation von anle138b begann am Tag der Inokulation beziehungsweise 80 oder 120 Tage später. Je früher die Verabreichung, umso länger überlebten die Mäuse (bis zu 200 Tage, bemessen an einem Grenzwert von 50% Todesfällen). (b) Die Proteinablagerungen in den Zellen waren, parallel zur Verzögerung der Todesfälle, deutlich reduziert. (c) Die Größenverteilung der krankheitsverursachenden Oligomere war hin zu kleineren Aggregaten verschoben, was ebenfalls in Korrelation mit den Beobachtungen in a und b gesetzt werden kann. DMSO: Dimethylsulfoxid (Kontrollsubstanz). [weniger]

Anle138b wurde auch an mehreren Parkinson-Mausmodellen getestet, bei denen das Protein α-Synuclein Lewy Körperchen bildet. Ein von Francisco Pan-Montojo entwickeltes Mausmodell basiert auf topische Applikation von Rotenon, einem Pestizid, im Darm. Es verursacht Parkinson vergleichbare Symptome, weil es die prionenartige Ausbreitung von Proteinaggregaten zwischen den Neuronen bewirkt [7]. Diese Art der Ausbreitung von Neuron zu Neuron wurde bereits im Jahr 2006 von Braak und Braak aufgrund von Autopsieresultaten postuliert. Die beiden Wissenschaftler vermuten, dass sich α-Synuclein Aggregate von der Peripherie - zum Beispiel Darm oder Nase: nicht wenige Parkinsonkranke verlieren ihr Riechvermögen 10 bis 15 Jahre vor dem Einsetzen der typischen Beschwerden - zum Zentrum des Hirns, insbesondere zur substantia nigra, ausbreiten und so die parkinsontypischen Symptome hervorrufen [8], was kürzlich auch durch in vitro und in vivo Experimente plausibel gemacht werden konnte [9]. Die tägliche Gabe von Rotenon in den Darm einer Maus führt zur α-Synuclein Aggregation nach etwa sechs Wochen und zum Absterben der Neurone im Darm. Dagegen beobachtet man bei den dopaminergen Neuronen in der substantia nigra der Mäuse erst nach drei bis vier Monaten eine Abnahme der Neurone. Verabreicht man dagegen anle138b, verhalten sich die Mäuse in Bezug auf ihre motorische Leistungsfähigkeit deutlich besser als diejenigen Mäuse, die kein anle138b erhalten haben (Abb. 3). Interessanterweise ist die Leistungsfähigkeit der Rotenon behandelten Mäuse nach Gabe von anle138b vergleichbar mit der Leistungsfähigkeit von Rotenon behandelten Mäusen, deren Vagus oder Sympathicus durchtrennt wurden und somit der Ausbreitungsprozess über die peripheren Nerven ins Gehirn zu mindestens 50% unterbrochen wird.

<strong>Abb. 3:</strong> Effekt auf die motorische Leistungsfähigkeit eines Parkinson-Mausmodells, bei dem eine Ausbreitung von Rotenon-induzierten α- Bild vergrößern
Abb. 3: Effekt auf die motorische Leistungsfähigkeit eines Parkinson-Mausmodells, bei dem eine Ausbreitung von Rotenon-induzierten α-Syn Aggregaten vom Darm zur substantia nigra bewirkt wird. Die Rotenon behandelten Tiere sind weniger leistungsfähig als die nicht mit Rotenon behandelten Tiere. Die anle138b plus Rotenon behandelten Tiere wiederum zeigten sich leistungsfähiger als die Rotenon behandelten Tiere und nach 4 Monaten genauso leistungsfähig wie diejenigen Rotenon behandelten Tiere, bei denen der Vagus durchgetrennt worden war, und sich die α-Syn Aggregate somit nicht prionenartig ausbreiten konnten. Rotarod: Laufrad, mit dem die motorische Koordination und Ausdauer einer Maus gemessen werden kann. [weniger]

In einem Maus A30P-α-Syn Überexpressionsmodell wurde eine Reduktion der Bildung von Lewy Körperchen und interessanterweise auch hier wieder eine Umverteilung der Größe und der Konzentration von Monomeren und Oligomeren, ähnlich wie im Fall des Prionproteins, beobachtet.

Ausblick

Die Inhibition der Aggregation von zwei so verschiedenen Proteinen wie Prion-Protein und α-Synuclein in vitro und in vivo ist erstaunlich, ist doch normalerweise die chemische Spezifität von Verbindungen mit der Sequenzabfolge der Aminosäuren im Target verbunden. Auf der anderen Seite sind Farbstoffe wie Kongorot oder Thioflavin S, die für die Anfärbung von Amyloid-Fibrillen verwendet werden, ebenfalls relativ sequenzunspezifisch. Vielleicht lassen sich die Daten wie folgt erklären: anle138b, das Monomere nicht bindet, stabilisiert eine nicht-toxische, kleine Aggregatspezies unter thermodynamischer Kontrolle und verhindert so die Bildung von toxischen Oligomeren und Fibrillen. Dem Strukturbiologen bietet sich damit die interessante Möglichkeit des Studiums eines Komplexes aus einem kleinen Molekül und einem Proteinaggregat. Für den chemischen Biologen wiederum ergibt sich die Möglichkeit, anle138b als Testsubstanz zu verwenden, um zellbiologische Veränderungen im Allgemeinen zu beobachten. Dank der Ausgründung der MODAG GmbH, die sich mit der Erforschung und Entwicklung von Therapeutika und Diagnostika für neurodegenerative Erkrankungen befasst, ist es möglich, anle138b sehr bald für eine Phase I Studie am Menschen einzusetzen.

Literaturhinweise

1.
Valera, E.; Masliah, E.
Immunotherapy for neurodegenerative diseases: Focus on α-synucleinopathies
2.
Bertoncini, C. W.; Jung, Y.-S.; Fernandez, C. O.; Hoyer, W.; Griesinger, C.; Jovin, T. M.; Zweckstetter, M.
Release of long-range tertiary interactions potentiates aggregation of natively unstructured α-synuclein
3.
Lashuel H. A.; Hatley, D.; Petre, B. M.; Walz, T.; Lansbury Jr, P. T.
Amyloid pores from pathogenic mutants
4.
Karpinar, D. P.; Balija, M. B. G.; Kügler, S.; Opazo, F.; Rezaei-Ghaleh, N.; Wender, N.; Kim, H.-Y.; Taschenberger, G.; Falkenburger, B. H.; Heise, H.; Kumar, A.; Riedel, D.; Fichtner, L.; Voigt, A.; Braus, G. H.; Giller, K.; Becker, S.; Herzig, A.; Baldus, M.; Jäckle, H.; Eimer, S.; Schulz, J. B.; Griesinger, C.; Zweckstetter, M.
Pre-fibrillar α-synuclein variants with impaired β-structure increase neurotoxicity in Parkinson's disease models
5.
Wagner, J.; Ryazanov, S.; Leonov, A.; Levin, J.; Shi, S.; Schmidt, F.; Prix, C.; Pan-Montojo, F.; Bertsch, U.; Mitteregger-Kretzschmar, G.; Geissen, M.; Eiden, M.; Leidel, F.; Hirschberger, T.; Deeg, A.A.; Krauth, J.J.; Zinth, W.; Tavan, P.; Pilger, J.; Zweckstetter, M.; Frank, T.; Bähr, M.; Weishaupt, J.H.; Uhr, M; Urlaub, H.; Teichmann, U.; Samwer, M.; Bötzel, K.; Groschup, M.; Kretzschmar, H.; Griesinger, C.; Giese, A.
Anle138b: a novel oligomer modulator for disease-modifying therapy of neurodegenerative diseases such as prion and Parkinson’s disease
6.
Bieschke, J.; Giese, A.; Schulz-Schaeffer, W.; Zerr, I.; Poser, S.; Eigen, M.; Kretzschmar, H.
Ultrasensitive detection of pathological prion protein aggregates by dual-color scanning for intensely fluorescent targets.
7.
Pan-Montojo, F.; Anichtchik, O.; Dening, Y.; Knels, L.; Pursche, S.; Jung, R.; Jackson, S.; Gille, G.; Spillantini, M. G.; Reichmann, H.; Funk R. H. W.
Progression of Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of rotenone in mice
8.
Braak, H.; de Vos, R. A.; Bohl, J.; Del Tredici, K.

Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner’s and Auerbach’s plexuses in cases staged for Parkinson’s disease-related brain pathology

9.
Desplats, P.; Lee, H. J.; Bae, E. J.; Patrick, C.; Rockenstein, E.; Crew, L.; Spencer, B.; Masliah, E.; Lee, S. J.
Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein
 
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