Neurobiologie • Zellbiologie

Forschungsbericht (importiert) 2007 - Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie

Freisetzung von Neurotransmittern und Hormonen: Sehr ähnlich und doch ganz anders

Release of neurotransmitters and hormones: similar and totally different

Autoren

Neher, Erwin

Abteilungen

Membranbiophysik (Prof. Dr. Erwin Neher)
MPI für biophysikalische Chemie, Göttingen

Die Freisetzung unterschiedlichster Signalstoffe erfolgt nach sehr ähnlichem Muster. In den Nervenendigungen ist der Neurotransmitter in Speicherbläschen, sog. Vesikeln, verpackt und wird vom Nervenimpuls durch Exozytose, d. h. Verschmelzung der Vesikel mit der Zellmembran, freigesetzt. Auf ganz ähnliche Art werden Hormone aus Drüsenzellen freigesetzt. Dabei greifen die zellulären Mechanismen der Exozytose auf dieselben molekularen Bausteine zurück. Dennoch ist bei genauer Betrachtung die Regulation der Freisetzung sehr unterschiedlich. Die meisten dieser Unterschiede sind wohl darauf zurückzuführen, dass an der Nervenendigung die beteiligten Elemente – Speichervesikel und kaliumspezifische Ionenkanäle – in hochregulierter Form zusammengeführt werden.
The release of signalling molecules from a variety of cell types proceeds along very similar lines. In nerve endings neurotransmitter is stored in membrane bound containers, so called vesicles. It is released on arrival of a nerve impulse by the process of exocytosis, i. e. fusion of the vesicle with the cellular membrane. Release of hormones from gland cells follows a similar pattern. The underlying cellular mechanisms utilize the same molecular building blocks in both systems. Nevertheless, the regulation of both processes turns out to be very different on close inspection. Most of these differences may reside in the fact, that at nerve endings the most important players – vesicles and calcium specific ion channels – are linked together in a highly-regulated and specific fashion.

Synapsen sind die Schaltstellen unseres Nervensystems. An ihnen wird der Nervenimpuls von einer Zelle auf die nächste übertragen. Unser Gehirn ist ein Netzwerk von etwa 100 Milliarden Nervenzellen, wobei jede mit mehreren Tausend anderen Zellen über solche Kontakte in Verbindung steht. Im Gegensatz zu elektronischen Datenverarbeitungsanlagen, wo die einzelnen Schaltelemente starr miteinander verbunden sind, sind die Synapsen des Gehirns dynamisch – sie ändern ihre Verbindungsstärke je nach Signaldurchfluss. Es ist diese sog. ,Plastizität‘ der Signalweiterleitung, in der die meisten Neurowissenschaftler die hervorgehobenen Leistungen des Gehirns verankert sehen. Daher ist es auch besonders interessant, die Mechanismen dieser Signalübertragung zu erforschen und herauszufinden, warum sich die Synapsenstärke bei ,Gebrauch‘ stetig ändert.

Was hat dies mit Hormonausschüttung zu tun? Schon früh – in den 50er- und 60er-Jahren des letzten Jahrhunderts – hat sich gezeigt, dass beide Prozesse einige wichtige Schritte gemeinsam haben. Erreicht ein Nervenimpuls die Nervenendigung, so wird in Bruchteilen einer tausendstel Sekunde eine Überträgersubstanz, der Neurotransmitter, ausgeschüttet. Dieser wirkt auf die nachgeschaltete Zelle, indem er dort Ionenkanäle öffnet, die wiederum ein elektrisches Signal erzeugen. Die Verbindung zur Ausschüttung von Hormonen besteht darin, dass dieser Prozess ganz analog zur Freisetzung des Neurotransmitters erfolgt. In beiden Fällen

- ist das auslösende Signal ein elektrischer Impuls in der freisetzenden Zelle;
- öffnet dieser Kalzium-spezifische Ionenkanäle, die zum Einstrom von Kalzium in die Zelle und zu einem Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration ([Ca++]) führen;
- ist die freisetzende Substanz in Speicherbläschen, sog. Vesikeln verpackt;
- führt der [Ca++] -Anstieg zur Exozytose, der Verschmelzung der Vesikel mit der Zellmembran und somit zum Austreten des Vesikelinhalts.

Das weitere Schicksal der freigesetzten Substanz ist natürlich ganz unterschiedlich: Das Hormon, beispielsweise Adrenalin, wird in die Gewebsumgebung und schließlich in die Blutbahn abgegeben. Dadurch löst es es an verschiedenen Zielorganen unterschiedlichste Reaktionen aus. Der Neurotransmitter wirkt nur etwa eine tausendstel Sekunde und wird dann entweder schnell enzymatisch abgebaut oder in benachbarte Zellen aufgenommen. Aber auch die oben aufgezählten Teilschritte der Freisetzung weisen bei genauerer Betrachtung erhebliche Unterschiede auf. Diese beziehen sich vor allem auf die ,Modulation‘ der Freisetzung: die Menge der freigesetzten Substanz wird durch andere, meist langsamer wirkende Signalstoffe beeinflusst. Auch die im Zusammenhang mit synaptischer Plastizität angesprochenen Änderungen sind Prozesse, die bei hormoneller Sekretion entweder fehlen oder auf ganz andere Art reguliert werden.

Messung der Adrenalinfreisetzung an einer chromaffinen Zelle des Nebennierenmarks. In der obersten Tafel werden zwei isolierte Zellen gezeigt. Eine da Bild vergrößern
Messung der Adrenalinfreisetzung an einer chromaffinen Zelle des Nebennierenmarks. In der obersten Tafel werden zwei isolierte Zellen gezeigt. Eine davon wird von einer Messpipette aus Glas (von rechts) kontaktiert. Außerdem wurde eine Mikrokohlefaser (von links) an die Zelle herangeführt. Mit dieser Kohlefaser kann auf elektrochemischem Wege das freigesetzte Adrenalin nachgewiesen werden. Mit der Messpipette wird auf elektrischem Wege die Membranoberfläche bestimmt, die bei Exozytose zunimmt, wenn Vesikel mit der Membran verschmelzen. Die untere Bildhälfte zeigt die elektrochemisch gemessene Adrenalinausschüttung (unten) sowie die Oberflächenzunahme (Mitte), wenn durch photolytische Freisetzung die Ca++-Konzentration (obere Spur) schrittartig erhöht wird. In Bruchteilen einer Sekunde werden die sekretionsbereiten Vesikel freigesetzt (,slow burst‘, ,fast burst‘). Danach steigt die Oberfläche kontinuierlich an (sustained component) was durch weitere Freisetzung neu bereitgestellter Vesikel zustande kommt. Einige wenige dieser Vesikel führen zur Adrenalinausschüttung in unmittelbarer Nachbarschaft zur Kohlefaser, was sich durch diskrete Signalspitzen bemerkbar macht. [weniger]

Zwei Präparate zum Studium der Freisetzung von Signalstoffen

Die Abteilung Membranbiophysik am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie konzentriert ihre Forschungsarbeit seit einigen Jahren auf die Mechanismen der Freisetzung von Hormonen und Neurotransmittern mit teils vergleichenden, teils komplementären Ansätzen. Der komplementäre Ansatz ist von Vorteil, da am Drüsengewebe oder an isolierten Drüsenzellen sehr viel leichter funktionelle Studien mit molekularbiologischen Ansätzen verbunden werden können, als dies am Nervengewebe der Fall ist. Als Präparate für diese Versuche dienen die chromaffinen Zellen des Nebennierenmarks, die im Stresszustand Adrenalin freisetzen (Abb. 1). In der Abteilung entwickelte Methoden erlauben es, Freisetzungsreaktionen an einzelnen Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung zu verfolgen. Es ist relativ einfach, dies mit Zellen transgener Tiere durchzuführen, selbst wenn die genetischen Veränderungen zu perinataler Letalität führen. In diesem Fall wird Drüsengewebe von neugeborenen Tieren enzymatisch dissoziiert und die Zellen werden in Kultur genommen. Dies ermöglicht ein Studium der Sekretionseigenschaften über mehrere Tage hinweg. Dabei können auch ,Wildtyp‘ oder mutierte Proteine mittels Viren oder mit anderen Methoden der Transfektion exprimiert werden und somit die ursprünglichen Funktionen wiederhergestellt oder veränderte Funktionen induziert werden [1].

Demgegenüber gestalten sich Versuche, die Ausschüttung von Neurotransmittern aus Nervenendigungen genetisch zu beeinflussen, als sehr viel schwieriger. Es gelingt zwar, die an Drüsenzellen entwickelten Methoden an dissoziierten Neuronen des Hippocampus in Zellkultur einzusetzen [2]. Die damit gewonnenen Erkenntnisse sind jedoch nicht immer eindeutig interpretierbar, da Nervenendigungen in der Regel sehr klein sind und einer Messung mit Mikroelektroden nicht direkt zugänglich sind. Dies ist ganz anders bei einer speziellen Synapse in der Hörbahn, die sehr große kelchförmige Nervenendigungen aufweist (Abb. 2). Diese Synapse, die Held’sche Calyx, kann im akuten Hirnschnitt in der sog. „Spannungsklemme“ untersucht werden und es können verschiedene Phänomene der Kurzzeitplastizität – Kurzzeitbahnung und Kurzzeitdepression – ausgelöst werden. Allerdings ist es bislang nicht möglich, genetische Manipulationen am akuten Hirnschnitt durchzuführen. Der komplementäre Ansatz des Forscherteams um Erwin Neher besteht darin, die an der Drüsenzelle gewonnenen molekularen Informationen zu benutzen, um die mit einem eingeschränkten experimentellen Repertoire am Hirnschnitt gewonnenen Daten zu interpretieren. Das Interesse gilt dabei vor allem einem besseren Verständnis der Prozesse, die bei synaptischer Plastizität eine Rolle spielen – oder als Frage formuliert: Welche molekularen und zellbiologischen Parameter ändern sich, wenn sich die Synapsenstärke durch pharmakologische Intervention oder bei repetitiver Reizung verändert?

Der ,Held’sche Kelch‘, eine erregende Synapse der Hörbahn. Die linke Seite zeigt schematisch einen Schnitt durch den Hirnstamm und den Verlauf der Hör Bild vergrößern
Der ,Held’sche Kelch‘, eine erregende Synapse der Hörbahn. Die linke Seite zeigt schematisch einen Schnitt durch den Hirnstamm und den Verlauf der Hörbahn. Die Signale, die vom linken Ohr kommen (,auditory fibers‘) werden im ventralen nucleus cochlearis (,VCN‘) erstmals verschaltet und dann über die Mittellinie zur gegenüberliegenden Hälfte des Hirnstamms geführt. Dort findet im sog. Held’schen Kelch (Calyx of Held) eine weitere Verschaltung statt, bevor die Information vom linken Ohr auf die des rechten Ohres trifft. Die hohen Anforderungen des ,Richtungshörens‘ erfordern, dass die Informationen in den beiden Schaltstellen äußerst präzise weitergegeben werden. Dies ist wohl der Grund für die besondere Form der Calyx. Rechte Bildhälfte, oben: Schematische Darstellung der Calyx als eine Parallelanordnung sehr vieler Synapsen, wobei jede durch eine Anhäufung synaptischer Vesikel angedeutet ist. Unten: Ein Blick durch ein Fluoreszenzmikroskop mit schematisch eingezeichneten Messpipetten. Durch die rechte Messpipette (,pre‘) wurde ein Fluoreszenzfarbstoff in die präsynaptische Endigung eingeführt, sodass diese und auch die mit ihr verbundene Nervenfaser hell erscheint. [weniger]

Detailvergleich des Freisetzungsprozesses

Betrachtet man den Prozess der Exozytose und seiner Regulation im Detail, so lassen sich eine große Zahl von Gemeinsamkeiten finden:
- Sowohl bei der neuronalen als auch bei der hormonellen Sekretion wird Exozytose durch einen makromolekularen Komplex vermittelt, der aus denselben Komponenten, sog. SNARE-Proteinen (Syntaxin, Synaptobrevin, SNAP25) besteht;
- In beiden Fällen wird die Sekretion äußerst effektiv durch Clostridien-Neurotoxine (Tetanustoxin, Botulinumtoxin) unterbunden, da diese die SNARE Proteine proteolytisch spalten [3];
- [Ca++] ist in beiden Fällen ein äußerst effektiver Aktivator, wobei die Freisetzungsrate mit der 3. bzw. 4. Potenz der Kalziumkonzentration ansteigt;
- [Ca++] hat in beiden Systemen eine zweite, wesentlich langsamer ablaufende Wirkung auf die Bereitstellung sekretionsbereiter Vesikel;
- Der weitverbreitete sekundäre Botenstoff zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) bewirkt eine erhöhte bzw. beschleunigte Bereitstellung sekretionsbereiter Vesikel in beiden Systemen.

Die genaue Betrachtung macht jedoch erhebliche Unterschiede deutlich:
- Die meisten der molekularen Komponenten kommen im Organismus in mehreren Isoformen vor, wobei verschiedene Zelltypen bestimmte Isoformen bevorzugt exprimieren. So ist zum Beispiel eine durch alternatives Spleißen erzeugte Form von SNAP25, nämlich SNAP25-b, hauptsächlich in adulten Nervenzellen exprimiert, während die in nur neun Aminosäuren unterschiedliche Form SNAP25-a die dominierende Form in Drüsenzellen ist. Die Göttinger Wissenschaftler konnten zeigen, dass die ,neuronale‘ Isoform, wenn in Drüsenzellen exprimiert, zu einer größeren Anzahl sekretionsbereiter Vesikel führt [4]. Ähnliche Unterschiede in der ,Feinstruktur‘ der Fusionsmaschinerie sind wohl die Gründe dafür, dass die neuronale Sekretion um bis zu einem Faktor zehn schneller erfolgt und auch die Beziehung zwischen Sekretionsrate und [Ca++] an der Synapse steiler ist als in der Drüsenzelle.
- Die Regulation der Bereitstellung sekretionsbereiter Vesikel durch [Ca>sup>++] und cAMP erfolgt auf unterschiedlichem Wege: Im Falle der Drüsenzelle erhöht sich bei leichtem Anstieg von [Ca++] im Ruhezustand die Anzahl der sekretionsbereiten Vesikel. In ähnlicher Weise ist diese Anzahl von der Konzentration des cAMP abhängig. An der Nervenendigung jedoch ändert sich die Zahl der sekretionsbereiten Vesikel wenig, wenn das Ruhe-[Ca++] ansteigt. Vielmehr beschleunigt sich die Geschwindigkeit, mit der Vesikel wieder bereitgestellt werden, nachdem ein starker Reiz die Mehrzahl der sekretionsbereiten Vesikel freigesetzt hatte. Die beschleunigte Bereitstellung der Vesikel bedingt natürlich auch höheres Signalniveau während kontinuierlicher Aktivität der Nervenzellen. Im Falle der cAMP-abhängigen Regulation in Drüsenzellen hat sich herausgestellt, dass diese durch Phosphorylierung des SNARE-Proteins SNAP25 bedingt ist, was wahrscheinlich zu stabileren SNARE-Komplexen führt. Der an der Nervenendigung beobachtete dynamische Effekt auf die Vesikelbereitstellung wird jedoch nicht durch Phosphorylierung vermittelt.

Ein wesentlicher Grund für die unterschiedliche Regulation der Vesikelbereitstellung – im neuronalen Fall dynamisch bei einer nahezu konstanten Anzahl an sekretionsbereiten Vesikeln im Ruhezustand, im anderen Fall durch stark variierende Mengen an Vesikeln – ist wohl die Folge ausgeprägter morphologischer Spezialisierungen an den Nervenendigungen. Sog. ,aktive Zonen‘ auf der präsynaptischen Seite zeichnen sich aus durch Ansammlungen von Vesikeln in der Nachbarschaft von elektronenoptisch erkennbaren Verdickungen der Membran. Jüngere Untersuchungen haben gezeigt, dass dort synapsenspezifische Proteine verankert sind, die einerseits mit Vesikeln, andererseits mit Kalzium-spezifischen Ionenkanälen (Ca++-Kanälen) interagieren. Aus biophysikalischen Betrachtungen kann gefolgert werden, dass Einstrom von Kalzium während des Aktionspotenzials, der nur Bruchteile von Millisekunden andauert, nur dann zur Exozytose führen kann, wenn sich sekretionsbereite Vesikel in unmittelbarer Nachbarschaft zu Ca++-Kanälen befinden. Nur dort erreicht das Kalziumsignal die nötige Stärke. Es ist wohl die Aufgabe der Proteine der aktiven Zone, diese ,Nachbarschaftsbeziehungen‘ zu etablieren und zu regulieren. Es hat sich nämlich herausgestellt, dass an der Held’schen Calyx etwa nur die Hälfte der sekretionsbereiten Vesikel durch kurze, ,physiologische‘ Reize freigesetzt werden kann. Die zweite Hälfte ist zwar sekretionsbereit, da ein photolyisch erzeugter Ca++- Anstieg diese Vesikel ebenso schnell zur Exozytose bringt wie die ersteren. Sie sind jedoch offensichtlich zu weit von Ca+++-Kanälen und aktiven Zonen entfernt, als dass sie durch einen kurzdauernden Nervenimpuls beeinflussbar wären [5]. Interessanterweise wird diese Hälfte der Vesikel extrem schnell nach ,Verbrauch‘ wieder bereitgestellt, d.h. der Prozess der Anlagerung von Vesikeln an die Membran und der Aufbau der makromolekulären Komplexe, welche die Exozytose vermitteln, kann sehr schnell geschehen. Demgegenüber ,reift‘ die zweite Hälfte der Vesikelpopulation nur langsam und in einer Art und Weise, die durch [Ca++], cAMP und wahrscheinlich noch weitere Signalträger moduliert ist. Eine graphische Darstellung der postulierten Relationen zwischen Vesikeln, Ca++- Kanälen und der aktiven Zone ist in Abbildung 3 gezeigt. Diese ultrastrukturellen Aspekte sind wohl in der Drüsenzelle entweder gar nicht oder in sehr veränderter Form verwirklicht, was im Endeffekt die Regulation der Sekretion in beiden Systemen sehr unterschiedlich gestaltet. Man kann spekulieren und folgern, dass sich das Nervensystem, das ja entwicklungsgeschichtlich eine relativ junge ,Erfindung‘ ist, die zuvor existierenden humoralen Prozesse der Signalgebung zu eigen gemacht hat und darauf aufbauend eine ultrastrukturelle Spezialisierung entwickelt hat, um den Prozess zu beschleunigen und um zusätzlich neuro-spezifische Komponenten der Regulation einzuführen.

Hypothese zur räumlichen Anordnung von schematischen Vesikeln  (goldfarben) und Ca-Kanälen an einer aktiven Zone. Die aktive Zone ist durch  eine Schr Bild vergrößern
Hypothese zur räumlichen Anordnung von schematischen Vesikeln (goldfarben) und Ca-Kanälen an einer aktiven Zone. Die aktive Zone ist durch eine Schraffur hervorgehoben und beherbergt eine Vielzahl von Ca++-Kanälen (Rosetten). Drei Vesikel sind an die aktive Zone angebunden, drei weitere (die ,zweite‘ Hälfte; siehe Text) befinden sich in größerer Entfernung. Sie sind somit auch weiter von Ca++-Kanälen entfernt. Experimentell kann festgestellt werden, dass die entfernten Vesikel sehr schnell (mit einer Rate von 10s-1) bereitgestellt werden, während dies für die ,nahen‘ Vesikel im Ruhezustand etwa 40-mal langsamer erfolgt. Es ist noch nicht bewiesen, dass (wie angedeutet) die nahen Vesikel durch ,Reifung‘, d.h. Anlagerung an die aktive Zone aus den entfernten Vesikeln hervorgehen. Experimente belegen jedoch, dass die Etablierung spezifischer Nachbarschaft ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt für ,physiologische‘ Transmitterfreisetzung ist, der durch [Ca++] und cAMP reguliert wird. [weniger]

Originalveröffentlichungen

1.
Soerensen, J. B.:
Formation, stabilisation and fusion of the readily releasable pool of secretory vesicles.
2.
Rosenmund, C., Rettig, J., Brose, N.:
Molecular mechanisms of active zone function.
3.
Sakaba, T., Stein, A., Jahn, R., Neher, E.:
Distinct Kinetic Changes in Neurotransmitter Release after SNARE Protein Cleavage.
4.
Sorensen, J.B., Nagy, G., Varoqueaux, F., Nehring, R.B., Brose, N, Wilson, M. C., Neher, E.:
Differential control of the releasable vesicle pools by SNAP-25 splice variants and SNAP-23.
5.
Wadel, K., Neher, E., Sakaba, T.:
The coupling between synaptic vesicles and Ca2+Channels determines fast neurotransmitter release.
 
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