|
|
|
 |
|
|
| "Wieso zeigen DNA-Schmelzkurven einen sigmoiden ... |
 |
|
|
|
|
|
"Wieso zeigen DNA-Schmelzkurven einen sigmoiden Verlauf?"
|
|
Bild: Höbartner / MPIbpc
DNA-Schmelzkurven (% Einzelstrang-DNA in Abhängigkeit von der Temperatur) wie man sie bei phylogenetischer Verwandtschaftsuntersuchung mittels DNA-DNA-Hybridisierung findet, zeigen einen sigmoiden Verlauf. Derartige Kurvenverläufe kenn man von Sauerstoffbindungskurven von Hämoglobin, wo kooperative Effekte der Proteinuntereinheiten des Hb eine Rolle spielen. Wie lässt sich das Phänomen bei DNA erklären?
Gymnasium Leopoldinum, Detmold, Unterrichtsfach Biologie
Antwort:
-----
Desoxyribonukleinsäure (DNA) besitzt im nativen Zustand eine hoch geordnete Struktur. In der berühmten DNA-Doppelhelix werden die beiden komplementären Einzelstränge durch die Wechselwirkung verschiedener Kräfte zusammengehalten. Eine wichtige Rolle spielen dabei die Wasserstoffbrückenbindungen (H-Brücken) zwischen den Nukleinbasen innerhalb der Watson-Crick-Basenpaare. Darüber hinaus sind aber auch hydrophobe Wechselwirkungen der parallel aufeinander gestapelten Basenpaare von großer Bedeutung für die Stabilität der Doppelhelix.
In wässriger Lösung ist die doppelhelikale Struktur der DNA aber nicht unter allen Bedingungen stabil. Unter extremen Bedingungen, z.B. durch Erhitzen auf knapp unter 100 °C, oder durch Veränderung des pH-Wertes auf über 11.5, erfährt die DNA eine Strukturänderung, bei der es zur Trennung (Dissoziation) des Doppelstrangs in zwei Einzelstränge kommt. Dieser denaturierende Phasenübergang wird als Schmelzvorgang bezeichnet. Dabei ändern sich charakteristische Eigenschaften der DNA, wie z.B. die Absorption bei 260 nm, die optische Rotation, der Sedimentationskoeffizient oder die spezifische Viskosität.
Beim Schmelzvorgang wird die Basenstapelung aufgehoben, und die H-Brücken zwischen den Nukleinbasen werden getrennt. Die Temperatur, bei der 50 % der Basenpaare aufgebrochen sind – also 50% der Duplexe denaturiert vorliegen – wird als Schmelztemperatur bezeichnet. Die Schmelztemperatur ist charakteristisch für eine bestimmte DNA-Sequenz. Da zwischen Guanosin und Cytidin drei H-Brücken ausgebildet werden, aber im Fall von Adenosin-Thymin-Basenpaaren nur zwei H-Brücken existieren, hat DNA mit höherem GC-Gehalt auch eine höhere Schmelztemperatur.
Eine sehr einfache und weit verbreitete Methode, um den Schmelzvorgang der DNA zu beobachten, ist die Aufzeichnung der temperaturabhängigen Absorptionsänderung bei 260 nm mittels UV-Spektroskopie. Während der Temperaturerhöhung kommt es zu einer Zunahme der Absorption, weil sich der Absorptionskoeffizient der Nukleinbasen infolge der Strukturänderung ebenfalls verändert. Aufgrund der Basenstapelung hat doppelsträngige DNA einen geringeren molaren Absorptionskoeffizient als aus der Summe der molaren Absorptionskoeffizienten der einzelnen Nucleobasen berechnet wird. Dadurch kommt es beim Schmelzen der DNA zu einer Zunahme der UV-Absorption. Man bezeichnet dies als den hyperchromen Effekt (Hyperchromizität, angegeben als prozentuale Zunahme der Absorption). Wenn man nun die Änderung der UV-Absorption in Abhängigkeit von der Temperatur aufzeichnet, ergibt sich eine sigmoide Schmelzkurve, an deren Wendepunkt die Schmelztemperatur abgelesen wird.
Die Schmelzkurve hat einen sigmoiden Verlauf mit einem engen Temperaturintervall, in dem sich die Phasenumwandlung vollzieht. Das deutet auf einen kooperativen Schmelzvorgang hin. Die Analogie zum kooperativen Verlauf der Sauerstoffbindung an Hämoglobin ist im Prinzip richtig. Auch beim Schmelzen von DNA handelt es sich um einen kooperativen Prozess, der in erster Linie auf die Basenstapelung zurückzuführen ist. Man kann sich vorstellen, dass einzelne aufgeschmolzene Basenpaare (in den am wenigsten stabilen Bereichen der Doppelhelix) das Aufbrechen weiterer benachbarter Basenpaare begünstigen. Es konnte elektronenmikroskopisch gezeigt werden, dass längere Bereiche der DNA als Einheit schmelzen, und sich diese Bereiche mit noch doppelsträngigen Bereichen abwechseln. Bei einer bestimmten Temperatur kommt es dann zum sehr raschen Zusammenbruch der doppelhelikalen DNA Struktur und zur Trennung in die Einzelstränge. Das ist ähnlich wie beim Schmelzen kristalliner Substanzen, wobei sich die Phasenumwandlung ebenfalls in einem engen Temperaturintervall vollzieht.
Natürliche DNA hat einen sehr hohen Schmelzpunkt von häufig über 85 °C. Für synthetische DNAs, sogenannte Oligonukleotide, kann der Schmelzpunkt aus der Basenzusammensetzung und der Kettenlänge abgeschätzt werden, wobei aber auch die Ionenstärke der Lösung berücksichtigt werden muss. Die Schmelzkurve einer synthetischen 20 Basenpaare langen Duplex ist in der Abbildung dargestellt. Das Schmelzverhalten von Oligonukleotiden spielt in der Molekularbiologie z.B. bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eine sehr entscheidende Rolle.
Wie Sie in Ihrer Fragestellung angedeutet haben, lässt sich der Denaturierungs-Renaturierungsprozess von DNA für Abstammnungsnachweise verwenden. Dabei wird DNA von zwei unterschiedlichen Spezies geschmolzen, und die Analyse der Hybridisierungstemperatur gibt einen Hinweis auf die Verwandtschaft der beiden Organismen. Allerdings muss festgestellt werden, dass dieses Verfahren heute kaum noch Anwendung findet, weil durch die direkte Sequenzierung der DNA sehr viel genauere Analysen möglich sind.
|
|
|
Zur Person:
Dr. Claudia Höbartner studierte Technische Chemie an der Technischen Universität Wien und an der ETH Zürich und promovierte 2004 an der Leopold-Franzens-Universität Innsbruck. Als Erwin-Schrödinger-Stipendiatin des FWF (Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung, Österreich) ging sie im Anschluss für einen PostDoc-Forschungsaufenthalt an die University of Illinois in Urbana-Champaign (USA). 2007 kehrte sie an das Institut für Organische Chemie der Universität Innsbruck zurück und begann dort an ihrem Projekt “Struktur, Funktion und Mechanismus von Desoxyribozymen” zu arbeiten. Seit März 2008 leitet sie die unabhängige Nachwuchsgruppe „Nukleinsäurechemie“ am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie und erforscht dort, welche weiteren Aufgaben Nukleinsäuren neben der Informationsspeicherung und -übertragung erfüllen.
|
|
|
|
|
|
|
|
© 2012, Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, Göttingen |
|
|
Top