Neue Kraftmikroskope mit Anwendung in der Biologie

Dr. Tilman Schäffer, Abt. 060 (AG Raster-Sonden-Mikroskopie in der Abt. Molekulare Biologie)

Mikroskope eröffnen neue Welten, indem sie sie in Bildern sichtbar machen und dem Auge in anschaulicher Form vorführen. Diese Eigenschaft gibt Mikroskopen eine wichtige Rolle in der biologischen Forschung, denn die Grundbausteine der Biologie existieren in tausend- und millionenfach kleineren Welten als die Objekte unserer gewohnten Umgebung. Eine Vielzahl hochentwickelter Variationen des im 17. Jahrhundert erfundenen optischen Mikroskops sind heute im Einsatz. Häufig machen diese Mikroskope von der Wellennatur des Lichts Gebrauch und können mit Interferenz- und Fluoreszenzeffekten spezifischer und genauer in biologische Proben hineinsehen. Doch all diese Mikroskope kämpfen gegen die mit der Wellenlänge des Lichts gegebene Grenze des optischen Auflösungsvermögens. Neue Methoden wie zum Beispiel die in der Arbeitsgruppe von Stefan Hell an diesem Institut entwickelte Multiphotonen 4Pi-Mikroskopie nützen nichtlineare Effekte aus, um diese Grenze zu brechen. Optische Nahfeldmikroskope umgehen die Grenze ganz, indem sie das Fernfeld verlassen und im optischen Nahfeld messen. Doch auch mit hohen Anstrengungen sind optische Methoden bisher in der Regel auf eine Auflösung von 30-200 nm begrenzt. Elektronenmikroskope erreichen eine Auflösung unter einem Nanometer, doch zu dem Preis, daß die Probe speziell präpariert und unter Vakuum untersucht werden muß. Dadurch kann sich die Probe ungewollt verändern, und Untersuchungen in Flüssigkeiten, der natürlichen Umgebung vieler biologischer Objekte, sind nicht möglich.

Abb. 1: Prinzip des Kraftmikroskops mit optischer Lichtzeigerdetektion. Eine ultrascharfe Spitze tastet im Rasterverfahren eine Probe ab. Die Oberflächentopografie überträgt sich dabei in eine Auslenkung des Federbalkens. Ein positionsempfindlicher Photodetektor mißt diese Auslenkung durch die Spiegelung eines Laserstrahls am Balken. Eine Regelelektronik hält die Kraft der Spitze auf die Probenoberfläche konstant, indem sie die Probe der Oberflächentopografie entsprechend nach oben und unten bewegt.

Kraftmikroskope ertasten Oberflächen in deren natürlichen Umgebungen

Im Jahr 1986 wurde ein Mikroskop erfunden, das auf einem neuen Prinzip beruht. Im Zentrum dieses sogenannten Kraftmikroskops ist eine ultrascharfe Spitze, die im Rasterverfahren über eine Probenoberfläche bewegt wird [1, 2]. Die durch den Kontakt mit Oberflächenstrukturen entstehenden Kräfte werden von der Spitze auf einen Federbalken übertragen, der sich dadurch auslenkt (Abb.1). Typische Balken sind 100-200 µm lang und werden mit mikrolithographischen Methoden aus Silizium oder Siliziumnitrid hergestellt. Zur Detektion der Balkenauslenkung gibt es verschiedene Möglichkeiten, von denen sich die Lichtzeigermethode als die praktischste herauskristallisiert hat: Ein Laserstrahl wird von der Balkenrückseite wie von einem Spiegel reflektiert und auf einen positionsempfindlichen Photodetektor projeziert. Eine Auslenkung des Balkens resultiert dann in einer meßbaren Verschiebung des Laserstrahls auf dem Detektor. Mit der Lichtzeigermethode können vertikale Auslenkungen der Spitze mit sub-Ångström Genauigkeit gemessen werden. Zum Erzeugen von Bildern der Oberflächenstruktur bewegt ein piezoelektrischer Scanner die Probe im Rasterverfahren unter der Spitze hin und her, wobei die Auflagekraft der Spitze mit Hilfe eines Regelkreises konstant gehalten wird. Ein Computer erzeugt auf einem Bildschirm ein reliefartiges Abbild der Probenoberfläche. Quadratische Oberflächenausschnitte mit Kantenlängen von wenigen Nanometern bis hunderte von Mikrometern können abgetastet werden, wobei unter gewissen Bedingungen sogar einzelne Atome aufgelöst werden können [3]. Eine für biologische Proben besonders wichtige Eigenschaft des Kraftmikroskops ist, daß es Oberflächen in Lösung abtasten kann. So können einzelne Proteine und DNA unter physiologischen Bedingungen abgetastet und zeitabhängige Prozesse untersucht werden [4, 5].

Abb.2: Detektionsoptik eines Kraftmikroskops für kleine Federbalken. Ein einfallender Laserstrahl wird auf den Federbalken fokussiert. Der reflektierte Strahl wird von dem einfallenden Strahl mit einem polarisierenden Strahlteiler getrennt und auf den positionsempfindlichen Photodetektor gelenkt. Eine Linse nahe am Balken erzeugt die hohe numerische Apertur, die zur Erzeugung eines kleinen Fokusdurchmessers nötig ist. Eine CCD-Kamera, die in einer konfokalen Anordnung zum einfallenden Laserstrahl steht, erleichtert das Fokussieren.

Kleine Federbalken sind schneller und rauschärmer

Das Lichtzeigerprinzip hat sich so gut bewährt, daß heute fast alle Kraftmikroskope es verwenden. Allerdings verlangen viele fortgeschrittene biologische Anwendungen des Kraftmikroskops nach schnellerem und rauschärmerem Betrieb. Es gibt aber eine fundamentale physikalische Grenze der Abtastgeschwindigkeit und der Kraftauflösung von Kraftmikroskopen. Sie ist bedingt durch die thermisch verursachte Brownsche Bewegung des Balkens, die kleine Meßsignale überdeckt. Dieses Brownsche "Zittern" des Balkens kann jedoch durch die Verwendung von kleinen Balken reduziert werden [6]. Kleine Balken, die rauschärmer, schneller und nur wenige Mikrometer lang sind, haben mechanische Resonanzfrequenzen im Megaherzbereich und können nicht mehr in gewöhnlichen Kraftmikroskopen verwendet werden. Diese fokusieren nämlich den Laserstrahl nicht klein genug, so daß nicht genug Licht vom kleinen Balken zurückreflektiert wird. Man braucht neue Kraftmikroskope mit einem kleinen Fokusdurchmesser.

Ein kleiner Fokusdurchmesser wird in einem Aufbau des Kraftmikroskops realisiert, der eine Kombination computeroptimierter und beweglicher Linsen zum fokusieren des Laserstrahls auf den Balken verwendet (Abb.2) [7]. Die notwendige hohe numerische Apertur der Optik wird durch das Plazieren einer Linse im kleinen Abstand zum Balken erreicht. Der vom Balken reflektierte Laserstrahl wird mit dem einfallenden Laserstrahl überlappt, von diesem mit Hilfe eines polarisierenden Strahlteilers getrennt und auf den positionsempfindlichen Photodetektor gelenkt. Die räumlichen Abmessungen sind aus Stabilitätsgründen klein gehalten (48 mm Basislänge des Kraftmikroskop-Prototyps für kleine Balken in Abb.3). Bisher konnte ein Fokusdurchmesser von 1.6 µm erreicht werden [8] - eine Größenordnung kleiner als was in herkömmlichen Kraftmikroskopen erreicht wird, so daß auch dementsprechend kleinere Balken verwendet werden können. Auf einen ursprünglich spitzenlosen 20 µm langen Balken-Prototypen (Abb.4) wurde mit einem Elektronenmikroskop eine sogenannte EBD-Spitze (electron beam deposited tip) aufgetragen, so daß sich der Balken zum Abbilden von feinen Strukturen eignet. Ein 10 µm langer Balken mit einer EBD-Spitze wurde in einem Kraftmikroskop für kleine Balken zum Abbilden der Oberflächenstruktur von Perlmutt der Abalone-Seeschnecke verwendet (Abb.5).

Abb. 3: Prototyp eines Kraftmikroskops für kleine Federbalken. Alle Komponenten von Abb.2 sind in ihm enthalten, wobei die Basis aus Stabilitätsgründen nur 48 mm lang ist.

Abb. 4: Kleiner Federbalken aus Siliziumnitrid. Dieser Balken mit den Abmessungen 20 µm x 4 µm x 250 nm wurde mit mikrolithografischen Methoden aus einem Siliziumwafer hergestellt. Eine EBD-(electron-beam-deposited) Spitze mit hohem Aspektverhältnis wurde mit einem Elektronenmikroskop aufgebracht. Die laterale Auflösung des Kraftmikroskops ist im Wesentlichen durch die Schärfe der Spitze gegeben. Die (vertikale) Kraftauflösung wird mit kleinen Balken optimiert.

Abb. 5: Kraftmikroskopisches Abbild der Oberfläche von gespaltenem Abalone-Perlmutt, aufgenommen unter Wasser mit einem kleinen Balken. Dunkle Farben stellen tiefe Bereiche auf der Oberfläche dar, und helle Farben hohe Bereiche. Zum Abbilden wurde ein 10 µm langer Balken mit einer EBD-Spitze ähnlich der von Abb.4 verwendet. Der Balken wurde im sogenannten TappingMode in Liquid bei einer Frequenz von 442 kHz betrieben.

Das Wachstum von Perlmutt: Mineralbrücken zwischen organischen Schichten

Abalone-Perlmutt besteht aus einer regelmäßigen Anordnung von etwa 400 nm dicken Plättchen aus Aragonit-Einkristall (einer Kristallform von Calciumcarbonat) [9]. Diese Plättchen sind in Form von Wachstumskegeln aufeinandergestapelt, die an ihren Basen zusammenwachsen (Abb.6). Zwischen aufeinanderliegenden Plättchen befindet sich eine etwa 30 nm dicke organische Schicht (Abb.7). Obwohl diese organische Schicht nur etwa einen Anteil von 1-5% am Gesamtgewicht hat, ist sie entscheidend für die Materialeigenschaften des Perlmutts, denn Abalone-Perlmutt ist 3000 Mal bruchzäher als reines Aragonit [10]. Die Frage stellt sich, wie es die Abalone-Seeschnecke schafft, so ein Hochleistungsmaterial aus leichtem und billigem Calciumcarbonat (Kalkstein), bei Raumtemperatur, normalem Atmosphärendruck und neutralnahem pH zu formen. Da aufeinanderfolgende Aragonit-Plättchen eines Stapels die gleiche Kristallorientierung haben, glaubte man lange Zeit, daß die Aragonit-Plättchen auf den organischen Schichten in einer heteroepitaxialen Weise nukleieren. Die organischen Schichten würden in diesem Modell das vertikale Wachstum des darunterliegenden Plättchens beenden aber sich dessen Kristallorientierung einprägen. Dann würden darüberliegende Plättchen auf den organischen Schichten nukleieren, wobei sie die gleiche Kristallorientierung wie die darunterliegenden Plättchen vorgeschrieben bekämen. Ergebnisse neuer Untersuchungen mit Hilfe des Kraftmikroskops unterstützen allerdings ein anderes Modell [11]. Abbilder der organischen Schichten zeigen keinerlei Periodizitäten auf, die für das heteroepitaxiale Modell notwendig wären. Stattdessen sind Fasern und eine Vielzahl von Löchern zu sehen (Abb.8). Mit einer Modifikation des Kraftmikroskops, in der eine Mikro-Pipette anstelle der Spitze die Oberfläche abtastet, konnte gezeigt werden, daß diese Löcher für Ionen durchlässig sind. Zusammen mit elektronenmikroskopischen und statistischen Untersuchungen legt dieses Ergebnis ein neues Modell des Wachstums von Abalone-Perlmutt nahe: Die Aragonit-Plättchen bilden sich mit Hilfe von Mineralbrücken, die durch die Löcher der organischen Schichten wachsen und aufeinanderliegende Plättchen verbinden (Abb.9).

Abb. 6: Elektronenmikroskopische Aufnahme der Mikrostruktur von Abalone-Perlmutt (Querschnitt durch die Schalen-Innenoberfläche). Pyramidenähnliche Stapel aus Aragonit-Plättchen wachsen an ihren Basen zum Hochleistungsmaterial Perlmutt zusammen. Seine schillernden Farben werden von Interferenzeffekten der Lichtspiegelungen an den etwa 400 nm dicken Aragonit-Plättchen erzeugt

Abb. 7: Elektronenmikroskopische Aufnahme einer organische Schicht zwischen den Aragonit-Kristallen. So eine Schicht befindet sich zwischen jeden benachbarten Aragonit-Plättchen. Obwohl das Gewicht dieser organischen Schichten nur etwa 1-5% des Gesamtgewichts ausmacht, wird Perlmutt durch die organischen Schichten 3000 Mal bruchzäher, verglichen mit reinem Aragonit.

Abb. 8: Kraftmikroskopisches Abbild einer der organischen Schichten im Abalone-Perlmutt nach einer enzymatischen Behandlung mit Proteasen. Sichtbar sind Fasern (weiße Pfeile) und Löcher (dunkle Pfeile) mit Abmessungen im Nanometerbereich.

Abb. 9: Zwei konkurrierende Modelle der Bildung von Abalone-Perlmutt. Im alten Modell nukleieren die Aragonit-Plättchen heteroepitaxial auf den organischen Schichten. Im neuen Modell bilden sich die Plättchen ausgehend von Mineralbrücken, die durch die organische Schichten durchwachsen. Die Mineralbrücken verbinden somit die Plättchen zu einem Einkristall.

Kraftmikroskope sind Nano-Werkzeuge

Das Abbilden von Oberflächenstrukturen mit millionenfacher Vergrößerung ist eine der großen Stärken des Kraftmikroskops. Eine weitere Stärke ist die Fähigkeit, mit der Spitze auf die Probe Einfluß zu nehmen. Während man genau dies beim Abbilden meist vermeiden und den Einfluß der Spitze auf die Probe minimieren will, eröffnet sich durch diese Manipulationsfähigkeit eine Fülle von neuen Anwendungen. Die Spitze kann mechanischen Kontakt auf kleinster Fläche herstellen und die Kräfte, die daraus entstehen, mit hoher Genauigkeit messen. Dadurch lassen sich nicht nur mechanische Probeneigenschaften wie Elastizität und Adhäsion mit einer Positionsgenauigkeit von wenigen Nanometern messen, sondern es lassen sich auch Moleküle mechanisch auf der Oberfläche verschieben und positionieren. Dabei kann die Spitze mit einer chemisch oder biologisch aktiven Oberfläche beschichtet werden um spezifische Wechselwirkungen hervorzurufen.

Eine besonders spektakuläre Anwendung des Kraftmikroskops ist seine Fähigkeit, Moleküle im wahrsten Sinne des Wortes "auseinanderzuziehen". Makromole-küle wie Proteine und DNA können zwischen der Spitze des Kraftmikroskops und der Probenoberfläche "eingespannt" und auseinandergezogen werden (Abb.10). Dabei wird die Kraft als Funktion des Abstands gemessen. Aus diesen Kraft-Abstandskurven können Informationen über mechanische Eigenschaften des Moleküls extrahiert werden. Manche Moleküle bestehen aus mehreren Domänen, welche sich bei Anwendung einer Kraft einzeln entfalten lassen. Das Muskelprotein Titin, zum Beispiel, besteht aus einer Serie von Immunoglobulin Domänen, deren Entfaltung in Kraft-Abstandskurven einzeln aufgelöst werden kann [12]. Die Kraft, die man zum Entfalten braucht, ist dabei abhängig von der Ziehgeschwindigkeit: Je schneller man zieht, desto größer wird die Entfaltkraft, desto stärker also muß man ziehen. Dieser Effekt hat seinen Ursprung in thermodynamischen Prozessen im Molekül. Zeitabhängige Kraft-Abstandskurven erlauben thermodynamische Gleichgewichtsparameter zu messen. Eine Grenze für die Geschwindigkeit, mit der man Moleküle auseinanderziehen kann, ist jedoch durch die Größe des Balkens gegeben. Große Balken sind bei der Bewegung durch die Flüssigkeit einer starken viskosen Reibung ausgesetzt, so daß ihre maximale Ziehgeschwindigkeit be-grenzt ist. Je kleiner der Balken, desto kleiner ist seine viskose Reibung. Mit einem kleinen Balken ähnlich dem von Abb.4 war es möglich, Titin mit einer Zieh-geschwindigkeit von 30 µm/s zu entfalten, eine Größenordnung schneller als mit herkömmlichen Balken (Abb.11). Die Fähigkeit zum schnellen Entfalten von Mole-külen ist besonders wichtig für den Vergleich mit theoretischen Modellen, die zum Beispiel in der Arbeitsgruppe Theoretische Molekulare Biophysik von Helmut Grubmüller an diesem Institut aufgestellt werden [13]. Molekulardynamische Be-rechnungen spielen sich in Zeitskalen von Picosekunden ab, während experimentelle Messungen viele Größenordnungen lang-samer sind. Kleine, schnelle Balken können dabei helfen, die Lücke zwischen Experiment und Theorie zu verringern.

Abb. 10: Prinzip des Auseinanderziehens von Molekülen mit dem Kraftmikroskop. Zuerst wird die Probe der Spitze angenähert, wo diese unter gewissen Umständen an ein einziges Molekül bindet. Dann wird die Probe nach unten weggezogen und damit Kraft auf das Molekül ausgeübt. Diese Kraft wird als Funktion des Abstands zwischen der Spitze und der Probe mit hoher Präzision gemessen. Es ergeben sich sogenannte Kraft-Abstandskurven.

Abb. 11: Kraft-Abstandskurve eines einzelnen Moleküls des Muskelproteins Titin, aufgenommen mit einem Kraftmikroskop für kleine Balken. Das Molekül wurde mit einem kleinen Balken mit einer Ziehgeschwindigkeit von 30µm/s auseinandergezogen. Dies ist eine Grössen-ordnung schneller als es mit herkömmlichen Balken möglich ist. Jedes der lokalen Kraft-Maxima in dieser Kurve entspricht der Entfaltung einer einzelnen Proteindomäne.

Diese Ergebnisse wurden erzielt in Zusammenarbeit mit den Gruppen von Paul Hansma, Galen Stucky und Daniel Morse an der University of California at Santa Barbara, und der Gruppe von Herrmann Gaub an der Universität München.

Literatur:
[1] Gerd Binnig, Calvin Quate, and Christoph Gerber, Atomic force microscope. Phys. Rev. Lett., 1986. 56(9): p. 930-3.
[2] Daniel Rugar and Paul Hansma, Atomic force microscopy. Physics Today, 1990. 43(10): p. 23-30.
[3] Frank Ohnesorge and Gerd Binnig, True atomic-resolution by atomic force microscopy through repulsive and attractive forces. Science, 1993. 260: p. 1451-1456.
[4] Manfred Radmacher, Monika Fritz, Helen Hansma, and Paul Hansma, Direct observation of enzyme activity with the atomic force microscope. Science, 1994. 265(5178): p. 1577-9.
[5] S. Kasas, N.H. Thomson, B.L. Smith, H.G. Hansma, X.S. Zhu, M. Guthold, C. Bustamante, E.T. Kool, M. Kashlev, and P.K. Hansma, Escherichia coli RNA polymerase activity observed using atomic force microscopy. Biochem., 1997. 36(N3): p. 461-468.
[6] Deron Walters, Jason Cleveland, Neil Thomson, Paul Hansma, Mark Wendman, Gus Gurley, and Virgil Elings, Short cantilevers for atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments, 1996. 67(10): p. 3583-3590.
[7] Tilman Schäffer, Jason Cleveland, Frank Ohnesorge, Deron Walters, and Paul Hansma, Studies of Vibrating Atomic Force Microscope Cantilevers in Liquid. Journal of Applied Physics, 1996. 80(7): p. 3622-3627.
[8] Tilman Schäffer, Mario Viani, Deron Walters, Barney Drake, Erik Runge, Jason Cleveland, Mark Wendman, and Paul Hansma, An atomic force microscope for small cantilevers. Proceedings of the SPIE - The International Society for Optical Engineering, 1997. 3009: p. 48-52.
[9] Lia Addadi and Stephen Weiner, Kontroll- und Designprinzipien bei der Biomineralisation. Angewandte Chemie, 1992. 104: p. 159-176.
[10] B.L. Smith, T.E. Schäffer, M. Viani, J.B. Thompson, N. Frederick, J. Kindt, A. Belcher, G.D. Stucky, D.E. Morse, and P.K. Hansma, Molecular mechanistic origin of the toughness of natural adhesives, fibres and composites. Nature (in press).
[11] T.E. Schäffer, C. IonescuZanetti, R. Proksch, M. Fritz, D.A. Walters, N. Almqvist, C.M. Zaremba, A.M. Belcher, B.L. Smith, G.D. Stucky, D.E. Morse, and P.K. Hansma, Does abalone nacre form by heteroepitaxial nucleation or by growth through mineral bridges? Chemistry of Materials, 1997. 9(8): p. 1731-1740.
[12] M. Rief, M. Gautel, F. Oesterhelt, J.M. Fernandez, and H.E. Gaub, Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science, 1997. 276(5315): p. 1109-12.
[13] Helmut Grubmüller, Berthold Heymann, and Paul Tavan, Ligand binding - molecular mechanics calculation of the streptavidin biotin rupture f orce. Science, 1996. 271(5251): p. 997-999.