Thomas Tuschl
RNA im Visier:
Eine Nachwuchsgruppe stellt sich vor
Thomas Tuschl
(AG Kombinatorische Biochemie )
Unsere Arbeitsgruppe "Kombinatorische Biochemie" wurde durch das Biofuture-Nachwuchsförderprogramm des BMBF ins Leben gerufen und zum 1.9.99 am MPIbpc gegründet. Wir analysieren RNA-prozessierende Ribonukleoprotein-komplexe, insbesondere das Spleißen von pre-mRNAs und die Doppelstrang-RNA-Interferenz. Neben klassischen biochemischen Verfahren verwenden wir mit Vorliebe kombinatorische Techniken um die molekularen Mechanismen und die Funktion der beteiligten RNA- und Protein-Komponenten aufzuklären.
Summary
Our young investigator group "Combinatorial Biochemistry" was started in September ´99 at the MPIbpc and is funded by a 2.6 Mio DM government Biofuture Grant. We are interested in RNA-processing and study nuclear splicing and double-strand RNA interference. Along with classical biochemical tools, we use combinatorial biochemical techniques to study the function of the RNA-components involved in RNA processing. Finally, we will explore the potential of such combinatorial techniques by developing a small molecule-based regulatory system to control gene expression in human gene therapy.
RNA-Prozessierung
Die genetische Information, d.h. das Erbgut eines Organismus, besteht aus chromosomaler DNA und ist in einzelne Gene unterteilt. Ein Gen ist durch die Abfolge eines 4-Buchstabenalphabets (dA, dC, dG, T) bestimmt und enthält die Information für die Synthese eines funktionellen Biopolymers (Proteine oder funktionelle RNAs). Beim Entschlüsseln eines Gens in der Zelle wird die DNA nicht direkt in das entsprechende Protein übersetzt, sondern zuerst in eine kurzlebige RNA transkribiert, die ebenfalls aus einem 4-Buchstabenalphabet (A, C, G, U) besteht. Bevor diese Vorboten-RNA oder pre-mRNA (pre-messenger RNA) jedoch in die Aminosäuresequenz des codierten Proteins translatiert wird, durchläuft diese eine weitere Zahl von Reifungsschritten (Abb. 1). Je komplexer der betrachtete Organismus, desto größer die Zahl der RNA-Prozessierungsschritte. In eukaryontischen Organismen, d.h. Organismen mit Zellkern, wie z. B. Hefe, Insekten, oder Säugetieren, liegt die für die Aminosäuresequenz der Proteine codierende Information nicht als eine kontinuierliche DNA-Sequenz vor, sondern ist fragmentiert in codierenden Exons und nicht-codierenden Introns (1). Bei der Genexpression wird diese DNA-Vorlage zunächst durch RNA-Polymerasen in eine kurzlebige RNA übersetzt. Diese wird dann dem Spleißvorgang unterworfen, in welchem die Introns entfernt und die Exons miteinander "verschweißt" werden. Das Spleißen der pre-mRNA wird von RNA-Protein-Komplexen ausgeführt, den sogenannten RNPs. Neben dem Spleißvorgang zählen außerdem noch die Bildung des 5'-Cap, des 3'-polyA-Schwanzes sowie mRNA-Editierung zum mRNA Reifungsprozess.
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| Abbildung 1: Von DNA zum Protein. Schema der eukaryontischen Genexpression |
| Figure 1: Scheme of the eukaryotic gene expression. |
Doppelstrang-RNA-Interferenz
Die Regulation der Genexpression wird nicht nur durch die Transkription bestimmt, sondern auch durch die nachfolgende RNA-Prozessierung und Translation. Vor kurzem wurde ein neuer Regulationsmechanismus bei der Genexpression entdeckt, der posttranskriptional wirkt. Der Vorgang wird durch die Anwesenheit doppelsträngiger RNA, die identisch oder sehr homolog zur Sequenz der mRNA des untersuchten Genes sein muß, initiert und als dsRNA-Interferenz bezeichnet (2). Die dsRNA bewirkt auf noch ungeklärte Weise den spezifischen Abbau der homologen mRNA und verhindert somit die Proteinproduktion. Um die Genfunktion eines Organismus zu untersuchen, wird heute dsRNA im Wurm, der Fliege, dem Fisch und sogar im Maus-embryo injiziert und der resultierende Knock-out Phenotyp untersucht. Daraus lassen sich Rückschlüsse über die Genfunktion gewinnen. Diese neue Methode eignet sich für eine genomweite Analyse der Genfunktion in großem Maßstab und ist zeitsparender als herkömmliche Knock-out Technologien.
Um den Mechanismus dieser hochspezifischen RNA-Interferenz aufzuklären, haben wir ein in vitro System für dsRNA-Interferenz entwickelt, welches erlaubt, diesen Vorgang erstmals biochemisch zu charakterisieren (3). Unser System besteht aus einem Extrakt, der aus Fruchtfliegen-embryos gewonnen wird. Unter Verwendung radioaktiv markierter dsRNAs und mRNAs untersuchen wir in diesem Extrakt den Aktivierungsvorgang und die Prozessierung der dsRNA sowie den nachfolgenden Abbaumechansimus der mRNA.
RNA-Katalyse im Spleißosom?
Neben dsRNA-Interferenz sind wir an der Aufklärung des bislang noch unbekannten katalytischen Zentrums in Spleißosomen interessiert. Wir testen die Hypothese, daß Spleißen im wesentlichen RNA-katalysiert erfolgt (4) und greifen bei unseren Analysen der spleißosomalen RNA-Komponenten, den snRNAs, auf kombinatorische biochemische Methoden zurück. Die Bezeichnung "kombinatorisch" bedeutet, daß man ein Experiment mit einer Vielfalt an RNA-Molekülen beginnt, in welcher alle möglichen Sequenz-Kombinationen vorliegen. Dann selektiert man aus dieser Vielfalt einzelne funktionelle Moleküle (Abb. 2). Wir erzeugen in der Regel eine Molekülbank rund um eine gegebene RNA-Sequenz, die bis zu 1015 verschie- dene RNA-Moleküle enthält, und isolieren daraus katalytisch aktive RNAs, in welchen gleiche oder ähnliche Reaktionen wie im RNA-Proteinkomplex stattfinden (5). Dadurch gewinnen wir Hinweise auf den Mechanismus, z.B. daß eben eine Reaktion RNA-katalysiert erfolgt, und es werden kleine, strukturell charakterisierbare Systeme erzeugt. Solche Beobachtungen bestärken die Hypothese, daß die heute vor allem auf Proteinen basierenden Stoffwechsel und Zellstrukturen einmal in einer frühen RNA-basierenden Lebensform, einer RNA-Welt, evolvierten. Die ribosomale Proteinsynthese und die mRNA-Prozessierung sind möglicherweise noch verbliebene Zeugen des Übergangs von der RNA- zur heutigen protein-dominierten Lebensform.
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Abbildung 2: Kombinatorisches Selektionsverfahren.
Figure 2: Combinatorial selection protocol.
Aus einer Bank spleißosomaler U6 snRNA-Sequenzen haben wir ein RNA-Enzym selektiert, welches eine Reaktion analog zu der im ersten Schritt erfolgenden 2',5'-Verzweigungsbildung katalysiert (Abb. 3). U6 snRNA zählt zu den höchst konservierten Komponenten des Spleißosoms und ist vermutlich an der Bildung des katalytischen Zentrums beteiligt. Wie im Spleißosom greift in unserem selektierten RNA-Enzym eine Adenosin-2’-hydroxylgruppe am 5’-Phosphat eines Guanosines an und bildet eine 2’,5’-verzweigte Phosphodiesterbindung. Unser Ribozym benötigt für die Katalyse auch ein in U6 snRNA konserviertes Motiv (ACAGAGA-Segment). Mit Hilfe von Photocrosslinking und Röntgenstrukturanalyse möchten wir die molekularen Wechselwirkungen im Ribozym charakterisieren und untersuchen, inwieweit dieser von RNA katalysierte Vorgang auch auf das Spleißosom übertragbar ist. Bislang konnte den natürlichen spleißosomalen snRNAs in Abwesenheit der sonst assoziierten Proteinkomponenten keine katalytische Eigenschaft nachgewiesen werden.
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| Abbildung 3: Katalytische RNA. Konsensus-Sequenz des selektierten Ribozyms mit Parallelen zum Spleißosom. Katalytisch wichtige und konservierte Nukleotide sind umrahmt. Unter Freisetzung von Pyrophosphat wird in Anwesenheit von Magnesiumionen eine 2´,5´-verzweigte Phosphodiesterbindung gebildet. P1, P2, basengepaarte Regionen; fetter Strich, Basenpaar-Covariation. |
| Figure 3: Catalytic RNA. Consensus sequence of the selected ribozyme with similarities to the spliceosome. Conserved and catalytically important residues are boxed. The 2’,5’- branched phosphodiester bond is formed upon attack of an adenosine 2’-hydroxyl group at the 5’-terminal triphosphate with concomitant release of pyrophosphate. P1 and P2 refer to base-paired regions and a bold dash indicates base-pair covariation. |
Wirkstoff-basierte regulatorische Systeme für die Gentherapie
Kombinatorische Ansätze bieten sich an, um RNA- oder proteinsequenzbasierter Vorgänge in komplexer zellulärer Umgebung zu optimieren. Wir setzen diese Methode ein, um ein neues regulatorisches System für die Kontrolle der Transgenexpression in der Gentherapie zu entwickeln. Ein mit kleinen Wirkstoffen wechselwirkendes RNA-Motiv (Abb. 4A) wird so in ein Transgen eingesetzt werden, daß sich durch die RNA-Wirkstoff-Wechselwirkung das Spleißen und damit die Genexpression regulieren läßt (Abb. 4B). Hierzu werden retrovirale Sequenzbanken und mensch- liche Zellen in Kultur infiziert. Anschließend selektiert man die Zellen mit dem erwarteten regulierbarem Expressionmuster des Transgens und verwirft die nicht regulierbaren Zellen. Die für die Regulation verantwortlichen DNA-Sequenzen werden amplifiziert, mit Hilfe der Retroviren neu in Zellen integriert, und anschließend erneut selektiert, bis die optimalen Sequenzen angereichert und bestimmt werden können.
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| Abbildung 4: Regulation der Genexpression in Transgenen. (A) Tobramycin und Struktur eines Tobramycin-bindenden RNA-Aptamers. Das Aptamermotiv wurde durch in vitro Selektion aus einer RNA-Bibliothek mit 60 nt Zufallssequenz isoliert (7). Das Motiv besteht aus einer RNA-Haarnadelschleife, die spezifisch Tobramycin, aber keine strukturell verwandten Aminoglycoside bindet. Die Dissoziationskonstante beträgt 0.8 nM, was bedeutet, daß die Bindungsenergie equivalent zur Bildung mehrerer Basenpaare doppelsträngiger RNA ist. Das Binden eines kleinen Moleküls an ein Aptamermotiv kann daher RNA-Sekundärstrukturen dramatisch stabilisieren. Dieses Phenomen soll zur Aktivierung alternativer Spleißstellen genutzt werden. (B) Regulation der Genexpression durch Verwendung alternativer 5’ Spleißstellen. Die Exons sind als schwarze Boxen und das Intron als Linie dargestellt. Die alternativ spleißbare Region ist als Rechteck dargestellt und grau unterlegt und enthält sowohl das Tobramycin-Aptamer als auch ein Stop-Codon. In Abwesenheit von Tobramycin wird diese Region durch Spleißen an der stärkeren zum 3'-Ende gelegenen 5' Spleißstelle integriert. Die nachfolgende Translation bricht dann am integrierten Stop-Codon ab und erzeugt entweder inaktives Protein oder führt unmittelbar zur mRNA-Degradierung, die durch frühzeitige Stop-Codons hervorgerufenen werden kann. Tobramycinaufnahme induziert eine Strukturänderung oder Stabilisierung der pre-mRNA in der Nähe der starken Spleißstelle, aktiviert dadurch die alternative 5' Spleißstelle und erzeugt mRNA die nun für funktionelles Protein codiert.
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| Figure 4: Regulation of gene expression for transgenes. (A) Tobramycin and the structure of a tobramycin-binding RNA aptamer. The aptamer was selected from a random sequence pool with 60 randomized positions. It binds specifically to tobramycin and not other structurally related aminoglycosides. The dissociation constant of the complex is 0.8 nM, indicating that the free energy change for tobramycin binding is comparable to the formation of several base pairs of double-stranded RNA. This implies that binding of small molecules to RNA can significantly stabilize RNA second-ary structure, and that the insertion of RNA aptamers into pre-mRNAs could be sufficient to regulate pre-mRNA splicing. (B) Regulation of gene expression by alternative splicing with competing 5’ splice sites. Exons are represented as black boxes and introns as lines. The alternatively spliced region is illustrated in gray and contains the tobramycin aptamer and an in-frame stop codon. The strength of the competing 5’ splice sites will be selected so that the downstream splice site is preferentially used in the ab-sence of tobramycin and the upstream site in the presence of it. Inclusion of the alternatively spliced region in the absence of drug subjects the mRNA to nonsense-mediated decay and thereby prevents protein synthesis. The addition of tobramycin induces a structural change that inactivates the downstream 5’ splice site and activates the nearby upstream 5’ splice site. The correctly spliced mRNA is then translated into protein. |
Regulatorische RNA-Sequenzen für die Transgenexpression bieten den Vorteil immunsystemverträglich und problemlos in nicht-codierende Sequenzen des Transgenes einfügbar zu sein. Andere, bislang verfügbare Methoden greifen auf körperfremde regulatorische Proteine zurück, welche das Immunsystem im Menschen aktivieren und transgen-exprimierende Zellen zerstören würden. Die Regulation in Abhängigkeit eines kleinen Wirkstoffs bedeutet, daß erst beim "Schlucken" des Wirkstoffs die Transgen-Expression angeschaltet werden wird, wohingegen bei bisherigen Konzepten nach dem Einfügen des Transgenes keine Regulationsmöglichkeit mehr besteht. Ein auf immunverträglichen Humanproteinen basierendes regulatorisches System wird gerade auch beim Pharmaunternehmen ARIAD entwickelt (6). Erst durch die Verfügbarkeit eines risikoarmen Verfahrens werden zukünftige Gentherapiestudien in größerem klinischen Umfang möglich werden.
Bibliographie
(1) Moore M. J., Query, C. C., and Sharp, P. A. (1993) in The RNA World (ed. Gesteland, R. F. and Atkins, J. F.), Cold Spring Harbor Laborotory Press, Cold Spring Harbor, NY, 303-357; Burge, C. B., Tuschl, T., and Sharp, P. A. (1999) in The RNA World 2nd edition (ed. Gesteland, R. F., Cech, T. R., and Atkins, J. F.), Cold Spring Harbor Laborotory Press, Cold Spring Harbor, NY, 525-560.
(2) Fire, A. (1999) Trends Genet. 15, 358-363.
(3) Tuschl, T., Zamore, P. D., Lehmann, R., Bartel, D. P., and Sharp, P. A. (1999) Genes & Dev. 13, 3191-3197.
(4) Sharp, P.A. (1985) Cell 42, 397-400.
(5) Tuschl, T., Sharp, P. A., and Bartel, D. P. (1998) EMBO J. 17, 2637-2650.
(6) Rivera, V. M. et al. (1996) Nature Med. 2, 1028-1032.
(7) Wang, Y., and Rando, R. R. (1995) Chem. Biol. 2, 281-290.
