Hefe, das eukaryontische E.coli
Abt.150 (Abt. Molekulare Genetik )
Summary
Among all model organisms the yeast Saccharomyces cerevisiae is unique for several reasons: Yeasts are familiar to everyone who likes bread, wine or bear, it is of high industrial importance, and it has some genetic properties which make it an ideal experimental system. Moreover, eukaryotes are as easy to handle as bacteria. Therefore, it can be reasonable to study cellular processes first in yeast before switching to a more complicated system. We study the recycling of proteins from Golgi to endoplasmic reticulum (ER). Recycling is important to keep ER and Golgi proteins within these compartments and to prevent their passage to the vacuole. We found that the recycling requires the so-called COPI vesicles. The mechanisms underlying the sorting of proteins into these vesicles are presently under investigation in our lab.
Hefe als Modellorganismus
Der Titel dieses Artikels ist angelehnt an eine Überschrift in einem Lehrbuch für Molekulargenetik. Sie soll wohl verdeutlichen, wie populär inzwischen die Bäckerhefe (Abbildung 1) als Versuchsobjekt geworden ist. In einen anderen Lehrbuch wird dieser einzellige Pilz sogar als "Modellsystem" eingestuft. Es gibt nur eine geringe Zahl von biologischen Arten, die den Status eines sogenannten "Modellorganismus" erreicht haben. Die Gründe, weshalb sie das besondere Interesse der Wissenschaft erlangt haben, sind rein zweckmäßiger Natur. Deshalb sind die meisten sogenannten Modellorganismen recht unscheinbar. Die beliebtesten sind das Darmbakterium Escherichia coli, unsere Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana), der Schleimpilz Dictyostelium discoideum, ein Fadenwurm (Caenorhabditis elegans), die Taufliege Drosophila melanogaster und die Maus. Nicht-Biologen nehmen von diesen Geschöpfen meist nur dann Notiz, wenn sie als Krankheitserreger, als Unkraut im Garten oder als Schädlinge in der Speisekammer in Erscheinung treten.
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| Abbildung 1. Scanning-Laser-Mikroskop-Aufnahme von Hefezellen. Die gezeigten Zellen bilden ein verändertes Sec22-Protein, das am N-Terminus als Markierung ein grünfluoreszierendes Protein (GFP) trägt. Sec22p ist ein Protein, das hauptsächlich im endoplasmatischen Retikulum (ER) zu finden ist. Dementsprechend sieht man in der Abbildung die Kern-Membran selbst und ein feines Netzwerk unterhalb der Zellmembran leuchten. Diese Aufnahme, die von Stefan Jakobs (Arbeitsgruppe "Hochauflösende optische Mikroskopie") gemacht wurde, zeigt lebende Zellen. Die GFP-Sec22p produzierenden Zellen mussten im Unterschied zu den in Abbildung 3 gezeigten Zellen nicht fixiert, durchlässig gemacht und mit Antikörpern behandelt werden, um das Protein sichtbar zu machen. |
| Figure 1. Yeast cells viewed with a scanning laser microscope. The cells produce a modified version of the Sec22 protein. Sec22p is N-terminally tagged by the green fluorescent protein from the jellyfish Aequoria. Most of Sec22p is located in the endoplasmic reticulum (ER). Accordingly, fluorescence is concentrated around the nucleus. Part of the ER also forms a net-like structure beneath the plasma membrane. This picture taken by Stefan Jakobs (Research group ‘High Resolution Optical Microscopy’) shows living cells. To make the protein visible, no fixation and permeabilization of cells nor incubation with antibodies was necessary as in the case of immunofluorescence studies (Figure 3). |
S. cerevisiae ist da eine Ausnahme. Die Industrie produziert weltweit jährlich 2,5 Millionen Tonnen dieses Einzellers. Bei unseren Nachbarn in Dänemark ist die Hefe sogar so beliebt, dass die 5,3 Millionen Einwohner vor dem letzten großen Streikwochenende 3 Millionen Würfel Hefe hamsterten ("Die Hefekrise", DIE WELT, Ausgabe vom 5. Mai.1998). Man nutzt die kleinen Pilze schon seit ewigen Zeiten. Bis sich allerdings die Einsicht durchsetzte, dass es sich beim Bierbrauen oder Brotbacken um eine frühe Art von Biotechnologie handelt, musste man bis Louis Pasteur warten. Dessen ungeachtet war man mit der Droge Alkohol und dem Treib(haus)gas CO2, das so manchem Winzer beim Betreten des Weinkellers im Herbst zum Verhängnis wurde, schon seit den alten Ägyptern vertraut. Heute übersteigt die Weltproduktion an Ethanol das Volumen von 40 Milliarden Litern. Nur ein Bakterium der Gattung Zymomonas könnte den Hefen bei der Umsetzung von Zucker zu Alkohol Konkurrenz machen. Wegen der vielen Nebenprodukte, die Zymomonas liefert, wird die Produktion von Trink-Alkohol aber wohl immer eine Domäne der Hefen bleiben.
Grundlagenforschung mit einem wirtschaftlich so bedeutenden Organismus ist eigentlich ungewöhnlich. Aber neben ihren Fähigkeiten als Bioreaktoren sind die Hefen auch auf genetischem Gebiet zu Höchstleistungen fähig. Sie sind typische Eukaryonten mit Zellkern und Organellen wie endoplasmatisches Retikulum, Golgi-Komplex, Lysosomen und Mitochondrien. Wie die meisten Eukaryonten haben sie für gewöhnlich einen doppelten Chromosomensatz. Genau wie die Keimbahnzellen höherer Organismen können sie eine Meiose (Reduktionsteilung) durchlaufen, und dabei stellen sie einen genetischen Rekord auf: Die Rate des Austauschs von genetischem Material zwischen passenden Chromosomen ist bei diesen kleinen Pilzen weitaus die höchste unter allen daraufhin untersuchten Organismen. Bezogen auf jeweils einen gleich langen Abschnitt der DNA finden in Hefe 100 mal so viele Rekombinations-Ereignisse statt wie beim Menschen. Dabei müssen die Einzeller möglichst jeden Fehler vermeiden, denn ihre Gene sind weit dichter gepackt als bei anderen Eukaryonten. Verwechslungen würden fast unweigerlich wichtige genetische Information betreffen. Die Häufigkeit der Rekombination und die geradezu pingelige Genauigkeit bei der Reparatur von Fehlern haben das Interesse der Genetiker auf die kleinen Pilze gelenkt. Die Ergebnisse einiger inzwischen geradezu "klassischen" Arbeiten haben unter anderem zu einem Modell der Rekombination geführt, das heute noch gilt.
Was diese Experimente erleichterte, ist die Fähigkeit der Laborhefen, nach der Meiose erst einmal als haploide Organismen zu leben und sich weiter zu vermehren, d.h. sie können mit nur einem Chromosomensatz auskommen. Diese Eigenschaft macht es leicht, Mutanten zu erzeugen und deren Effekte zu analysieren. Aber erst durch den Aufschwung der Gentechnik offenbarte sich ein weiterer Vorteil der Hefen. Schleust man nämlich DNA in die Zellen ein, dann bauen die Hefen die DNA mit hoher Effizienz an genau den Stellen ein, die zur eingeschleusten DNA passen. Bei dieser sogenannten "homologen Rekombination" werden die freien Enden der eingeschleusten DNA-Stücke von den Hefe-Zellen dazu verwendet, eine vermeintliche Lücke im Chromosom zu schließen. In anderen genetischen "Modellorganismen", wie der Maus, geschieht das nur sehr selten an der richtigen, "homologen" Stelle, und in Drosophila gar nicht.
Weil die Veränderung und Zerstörung von Hefe-Genen so einfach ist, kann man relativ leicht Hefestämme herstellen, in denen gleichzeitig sechs bzw. acht verschiedene Gene zerstört sind (1,2). Die erste der beiden Publikationen ist sicher rekordverdächtig, da man dort insgesamt 13 unterschiedliche Gen-Zerstörungen verwendet hat, die dann in verschiedenen Kombinationen ausgetestet wurden. Es ist sicher mit viel größerem Aufwand verbunden, solche Mutanten bei der Maus herzustellen. Dazu kommt noch, dass in der Maus die Zerstörung nur eines einzigen der entsprechenden Gene tödlich ist (3,4). Warum das so ist, muss noch geklärt werden.
Vesikuläre Transportprozesse zwischen ER und Golgi-Komplex in der Hefezelle
Bei den gerade erwähnten Beispielen handelt es sich jeweils um Genfamilien, deren Produkte im vesikulären Transport innerhalb der Zelle eine Rolle spielen. Vesikel-vermittelter Proteintransport zeichnet sich dadurch aus, dass zunächst Proteinkomplexe auf der Membran anlagern (Abbildung 2). Es bildet sich eine Art Schale um das neue Vesikel – eine Vesikelhülle oder englisch ‘coat’. Die Bildung der Vesikelhülle geht einher mit der Beladung der Vesikel mit Frachtmolekülen und einer Verformung der Membran, so dass sich das Vesikel abschnüren kann. Die anschließende Freisetzung der Hülle und das "Zugänglich-machen" von spezifischen Rezeptoren (SNAREs; MPIbpc-News, Oktober 1997, Vorstellung der Abteilung Jahn) ermöglicht die Verschmelzung des Vesikels mit einer bestimmten Zielmembran.
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| Abbildung 2. Schematische Darstellung von Vesikel-Bildung und Vesikel-Fusion. Membran- umschlossene Zellkompartimente, die durch vesikulären Transport verbunden sind, wurden als farbige Scheiben dargestellt. Die Abbildung soll die wichtige Rolle von Hüllproteinen bei der Bildung der Vesikel veranschaulichen. |
| Figure 2. Schematical representation of vesicle budding and fusion. Membrane-bound organelles connected by vesicular transport are drawn as coloured discs. Note that the budding process and the coat formation are linked. |
Wir interessieren uns vor allem für den Transport zwischen dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und dem Golgi-Komplex in Hefe. Die Vesikel, die zwischen ER und Golgi unterwegs sind, tragen als Hülle Komplexe bestehend aus den sogenannten COPI- oder COPII-Proteinen (COP = ‘coat protein‘; Abbildung 3). Sie sind spezialisiert für den Rückwärts- und den Vorwärts-transport zwischen ER und Golgi. Um den Transport zwischen ER und Golgi zu untersuchen, benutzen wir als Sonden Membran-verankerte Proteine, die zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Komplex hin- und hertransportiert werden. Es sind dies das Sec22-Protein und das Emp47-Protein. Im "dynamischen Gleichgewicht" ist eines der Proteine, Sec22p, hauptsächlich im ER zu finden, während das zweite, Emp47p, sich zum größten Teil im Golgi aufhält (Abbildung 3, A und B). In Hefe lässt sich ER mit Immunfluoreszenz als Ring um den Zellkern sichtbar machen. Anfärbung des Golgi liefert dagegen ein punktförmiges Muster. Für Sec22p und Emp47p gilt das generelle Konzept, für das Günter Blobel im letzten Jahr den Nobelpreis für Medizin erhielt: Die Lokalisation von Proteinen innerhalb der Zelle wird durch eine Vielzahl von Sortier-Signalen kontrolliert. Beide Proteine behalten also nur deshalb ihre Lokalisation in der Zelle bei, weil sie entweder selbst spezielle "Adressanhänger" besitzen, oder an andere Proteine binden, die solche Signale tragen.
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| Abbildung 3. Die Proteine Sec22p und Emp47p zirkulieren zwischen dem ER und dem Golgi. Die mikroskopische Aufnahmen zeigen Wildtyp-Hefen (A und B) und Mutanten (C und D), bei denen mit Hilfe von Immunfluoreszenz das Sec22-Protein und das Emp47-Protein lokalisiert wurden. Im Gleichgewicht ist das meiste Sec22p im ER zu finden (sichtbar als grüner Ring um den Zellkern, A). Emp47p ist überwiegend im Golgi-Komplex lokalisiert (punktförmige Anfärbung, B). Zwischen ER und Golgi und umgekehrt wird der Transport durch Vesikel bewerkstelligt: der Vorwärtstransport durch COPII-Vesikel, der Rückwärtstransport durch COPI-Vesikel. Ob die Proteine diese Vesikel als Transportwege benutzen, kann man mit Hilfe von Mutanten leicht bestimmen. In Bild C ist die Abschnürung von COPI-Vesikeln unterbrochen. Dadurch staut das ER-Protein Sec22p im Golgi an. Umgekehrt kann man durch einen Block in der Bildung von COPII-Vesikeln Emp47p dazu bringen, im ER anzustauen (D). (Die rote Färbung in A und C beruht auf einer gleichzeitigen Anfärbung eines vakuolären Proteins Ypt7p.) |
| Figure 3. The Sec22 and the Emp47 proteins circulate between Golgi and ER. Sec22p and Emp47p were made visible using immunofluorescence in wild type (A and B) and mutant cells (C and D). Sec22p is mainly found in the ER and seen as a ring around the nucleus (A). Most of the Emp47 protein is present in the Golgi membranes. This usually results in a punctuate staining pattern (B). Anterograde and retrograde transport are mediated by COPII and COPI vesicles, respectively. To show that proteins recycle between Golgi and ER, mutants were employed which are either blocked in retrograde traffic (C) or anterograde traffic (D). Both proteins are trapped in the compartment from which the exit is blocked by specific mutations. (The red fluorescence in A and C is due to simultaneous staining of the vacuolar protein Ypt7p with antibodies). |
Sec22p ist ein Teil der Fusionsmaschinerie, die Transport-Vesikel brauchen, um mit der Zielmembran verschmelzen zu können. Es ist ein sogenanntes SNARE-Protein, ein Vesikel-spezifischer Rezeptor, der mit Rezeptoren auf der Zielmembran wechselwirkt und dabei die Membranfusion fördert (Abbildung 2). Emp47p dagegen ist ein Lectin-ähnliches Protein, dessen Funktion allerdings unbekannt ist. Beide Proteine sind integrale Membranproteine mit nur einer Membran-überspannenden Domäne. Während bei Sec22p der N-Terminus ("Anfang" des Proteins) ins Zytoplasma ragt und der C-Terminus (das "Ende") in der Membran versteckt ist, so ist bei Emp47p nur ein kurzer C-terminaler Stummel an der Membranoberfläche zugänglich. Dort trägt Emp47p einen typischen "Adress-Anhänger", ein sog. KXKXX-Sequenzmotiv. Es bindet direkt an ‘coatomer‘, einen Komplex aus 7 Proteinen, dem Hauptbestandteil der Hülle von COPI-Vesikeln.
Wir konnten zeigen, dass sowohl Emp47p, als auch Sec22p über COPI-Vesikel vom Golgi zum ER zurückgeführt werden (5,6,7). Dazu waren Mutanten sehr nützlich, mit deren Hilfe die einzelnen Komponenten der Recycling-Maschinerie ausgeschaltet werden konnten (Abbildung 3, C und D). Wie man sieht, kann man je nachdem, ob man speziell den Vorwärts-transport oder den Rückwärtstransport blockiert, die Verteilung von Sec22p und Emp47p umkehren. Nicht gezeigt ist das Verhalten von Emp47p, wenn man den COPI-abhängigen Rückwärtstransport ausschaltet. Dann nämlich landet Emp47p in der Vakuole (7).
Trotzdem sind noch viele Fragen offen:
Schlussbemerkung:
Zu all den Proteinen aus Hefe, mit denen wir arbeiten, gibt in Säugerzellen "Orthologe" - d.h. Proteine, mit denen sie strukturelle Verwandtschaft aufweisen. In der Regel üben diese Proteine in Hefe und Säugerzellen eine verwandte Funktion aus. Viele grundlegende Erkenntnisse, die in Hefe gemacht wurden, konnten tatsächich in Säugerzellen bestätigt werden. Das betrifft zum Beispiel die Funktion der COPII-Vesikel im Vorwärts- und die Rolle der COPI-Vesikel im Rückwärtstransport (11). Es kann bei wichtigen zellbiologischen Vorgängen aber auch Unterschiede zwischen verschiedenen Organismen geben. Diese Unterschiede können gleichwohl sehr instruktiv für die Bedeutung und den Stellenwert einzelner Phänomene sein. Zwei anschauliche Beispiele, die die Funktion des Golgi-Komplexes betreffen, wurden kürzlich beschrieben.
1. S. cerevisiae zeichnet sich dadurch aus, dass es morphologisch betrachtet keinen klassischen Golgi-Komplex gibt, den man sich in erster Näherung wie einen Stapel Pfannkuchen vorstellen kann. Stattdessen sind die "Pfannkuchen" einzeln in der Zelle verstreut. Bei einer Golgi-Färbung mit Hilfe von Immunfluoreszenz erhält man deshalb ein punktförmiges Muster wie in Abbildung 3B, wobei jeder Punkt einen "Pfannkuchen" repräsentiert. Eine der Bäcker-Hefe nahe verwandte Hefe (Pichia pastoris) dagegen hat ordentlich gestapelte Golgi-Zisternen. Es ist möglich, dass dieser scheinbar so gravierende Unterschied allein auf der veränderten Funktion eines einzigen Proteins beruht (12). Stapelung der Golgi-Membranen oder fehlende Stapelung ist also keine Frage von so grundsätzlicher Bedeutung. Diese Beobachtung hat etwas mit dem folgenden zweiten Beispiel zu tun.
2. Der Vergleich der Golgi-Strukturen vieler einzelliger Organismen wie Ciliaten (Wimpertierchen), Algen und Hefen mit denen von Säugerzellen kann ebenfalls sehr lohnend sein (13). Schließlich haben diese Studien dazu geführt, dass man in Säugerzellen überprüft hat, ob der Transport durch den Golgi-Komplex nicht eigentlich einen Reifungsprozess darstellt. Dies würde bedeuten, dass die zu transportierende Fracht gar nicht erst in Transport-Vesikel verpackt wird, sondern ständig in einer bestimmten Golgi-Zisterne bleiben. Die Aufgabe der abgehenden und eingehenden Vesikel wäre es dann lediglich, den Reifungsgrad kontinuierlich zu ändern, indem molekulare Werkzeuge, aber keinerlei Frachtmoleküle zugeführt und abtransportiert werden. Dies scheint tatsächlich der Fall zu sein (14). (Damit würde sich der Transport innerhalb des Golgi-Komplexes von dem in Abbildung 3 dargestellten Transport zwischen ER und Golgi drastisch unterscheiden.)
Die Arbeit mit einfachen Modellorganismen soll neben der Beantwortung grundlegender Fragen auch die Kenntnis über die Biologie des Menschen, dem "Topmodell" der Schöpfung, erweitern. Die Beispiele zeigen, dass es dabei nicht unbedingt nötig ist, dass die Versuchsobjekte dem Menschen möglichst ähnlich sind.
Literatur
1. Huang, K. M., DHondt, K., Riezman, H. and Lemmon, S. K. (1999) Clathrin functions in the absence of heterotetrameric adaptors and AP180-related proteins in yeast. EMBO Journal, 18, 3897-3908.
2. Springer, S., Chen, E., Duden, R., Marzioch, M., Rowley, A., Hamamoto, S., Merchant, S. and Schekman, R. (2000) The p24 proteins are not essential for vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4034-4039.
3. Zizioli, D., Meyer, C., Guhde, G., Saftig, P., vonFigura, K. and Schu, P. (1999) Early embryonic death of mice deficient in g-adaptin. J. Biol. Chemistry, 274, 5385-5390.
4. Denzel, A., Otto, F., Girod, A., Pepperkok, R., Watson, R., Rosewell, I., Bergeron, J. J., Solari, R. C. and Owen, M. J. (2000) The p24 family member p23 is required for early embryonic development. Curr. Biol., 10, 55-58.
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6. Schröder, S., Schimmöller, F., Singer-Krüger, B. and Riezman, H. (1995) The Golgi-localization of yeast Emp47p depends on its di-lysine motif but is not affected by the ret1-1 mutation in a-COP. J. Cell Biol. 131, 895-912.
7. Schröder-Köhne, S., Letourneur, F. and Riezman, H. (1998) a-COP can discriminate between distinct, functional di-lysine signals in vitro and regulates access into retrograde transport. J. Cell Science, 111, 3459-3470.
8. Boehm, J., Ulrich, H. D., Ossig, R. and Schmitt, H. D. (1994) Kex2-dependent invertase secretion as a tool to study the targeting of transmembrane proteins which are involved in ER-Golgi transport in yeast. EMBO J., 13, 3696-3710.
9. Boehm, J., Letourneur, F., Ballensiefen, W., Ossipov, D., Demolliere, C. and Schmitt, H. D. (1997) Sec12p requires Rer1p for sorting to coatomer (COPI)-coated vesicles and retrieval to the ER. J. Cell Science, 110, 991-1003.
10. Ossipov, D., Schröder-Köhne, S. and Schmitt, H. D. (1999) Yeast ER-Golgi v-SNAREs Bos1p and Bet1p differ in steady-state localization and targeting. J. Cell Science, 112, 4135-4142.
11. Schekman R, Orci L (1996) Coat proteins and vesicle budding. Science 271: 1526–1533.
12. Rossanese, O. W., Soderholm, J., Bevis, B. J., Sears, I. B., O'Connor, J., Williamson, E. K. and Glick, B. S. (1999) Golgi structure correlates with transitional endoplasmic reticulum organization in Pichia pastoris and Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol., 145, 69-81.
13. Becker, B. and Melkonian, M. (1996) The secretory pathway of protists: spatial and functional organization and evolution. Microbiol. Rev., 60, 697-721.
14. Bonfanti, L., Mironov, A. A. Jr, Martinez-Menarguez, J. A., Martella, O., Fusella, A., Baldassarre, M., Buccione, R., Geuze, H. J., Mironov, A. A. and Luini, A. (1998) Procollagen traverses the Golgi stack without leaving the lumen of cisternae: evidence for cisternal maturation. Cell, 95, 993-1003.
Danksagungen
Wir bedanken uns bei Donna Arndt- Jovin und Stefan Jakobs für die Hilfe bei den mikroskopischen Aufnahmen und bei unseren Mitarbeitern Hannegret Frahm, Tanja Neumann, Uwe Andag, Alex Matiach und Bernd Sander für ihren Einsatz im Labor. Besonderer Dank gebührt Dieter Gallwitz für seine Unterstützung.
